張琮 趙佩 楊盛 張占海 張清會

(南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院 1特需病區(qū)，河南 南陽 473000；2心血管內(nèi)科)

急性心肌梗死(AMI)的治療會引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，如何減輕MIRI是AMI臨床研究的熱點(diǎn)〔1，2〕。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，其可作為AMI診斷的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)〔3〕。miR-322-5p是miRNA家族成員，參與多種疾病發(fā)展進(jìn)程。研究表明，miR-322-5p在肺動脈高壓模型大鼠的右心室中〔4〕及高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞〔5〕中的表達(dá)水平降低。miR-322在脂多糖(LPS)刺激的小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-322能促進(jìn)細(xì)胞增殖，緩解炎性損傷〔6〕。本研究通過TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)5可能是miR-322-5p的靶點(diǎn)。PRMT5在缺氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷中上調(diào)表達(dá)，其過表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。PRMT5在缺血再灌注腎損傷和缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中表達(dá)增加，干擾其表達(dá)可減輕缺血再灌注和缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化損傷〔8〕。但miR-322-5p和PRMT5在H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá)、影響及兩者的關(guān)系目前還尚未可知。本課題建立H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2損傷模型，旨在研究miR-322-5p和PRMT5對H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響及miR-322-5p能否靶向PRMT5發(fā)揮作用，以期為MIRI的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 H9c2細(xì)胞系購自美國ATCC；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成；高糖/低糖DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自北京索萊寶；野生型(WT)和突變型(MUT)PRMT5熒光素酶載體、PRMT5小干擾RNA(si-PRMT5)、miR-322-5p模擬物(mimics)、小干擾RNA 陰性序列(si-NC)、miR-322-5p抑制劑(anti-miR-322-5p)、PRMT5過表達(dá)載體(pcDNA-PRMT5)、模擬對照序列(miR-NC)、空載體(pcDNA)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)和引物序列購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)所需試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Western印跡所需抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基)中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2H/R模型構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)分組〔9〕H/R模型建立：根據(jù)文獻(xiàn)〔9〕方法，將H9c2細(xì)胞用缺氧培養(yǎng)箱(95%N2、5%CO2)中飽和的低糖無血清DMEM培養(yǎng)基置于缺氧培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)3 h，然后換為完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)4 h。

1.2.3實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-322-5p和PRMT5 mRNA的表達(dá) 接種H9c2細(xì)胞至6孔板，接種密度為2×105個/孔。培養(yǎng)4 h后，分為對照(Con)組和H/R組。Con組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)7 h。H/R組：按1.2.2建立H/R模型。培養(yǎng)結(jié)束后，將各組細(xì)胞中總RNA用試劑盒進(jìn)行提取，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后行PCR反應(yīng)。引物序列：miR-322-5p上游5′-CAGCAGCAATTCATGTTTTGAA-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；PRMT5 上 游 5′-GGACGGAGAAGGGCAGACTA-3′，下 游 5′-CCCGCATCCAGAACATGGAA-3′；U6上 游5′-GTCGAGAGCTGAGCTGCAC-3′，下 游 5′-AGCGTAGCTCGGCCACGTA-3′；GAPDH上 游5′-CGATGCGCGCTGATCGCCC-3′，下 游 5′-GCGATGCTTTACTCTCTAC-3′。用2-ΔΔCt法分析miR-322-5p相對U6、PRMT5mRNA相對甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)量。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 接種H9c2細(xì)胞至6孔板，接種密度為2×105個/孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合為一層時，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉(zhuǎn)染miR-322-5pmimics、miR-NC、anti-miR-322-5p、anti-miR-NC、si-PRMT5、si-NC、共轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimics和pcDNA-PRMT5、miR-322-5pmimics和pcDNA，轉(zhuǎn)染時間6 h。實(shí)時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中miR-322-5p表達(dá)或Western印跡檢測PRMT5蛋白表達(dá)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果后，將各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5檢測MDA含量及SOD和GSH-Px活性 將轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimics、miR-NC、si-PRMT5、si-NC、共轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimics和pcDNA-PRMT5、miR-322-5p mimics和pcDNA細(xì)胞均接種至6孔板，接種密度為2×105個/孔。培養(yǎng)4 h后，均按1.2.2建立H/R模型，分別記為H/R+miR-322-5p組、H/R+miR-NC組、H/R+si-PRMT5組、H/R+si-NC組、H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組、H/R+miR-322-5p+pcDNA組。同時接種未轉(zhuǎn)染的H9c2細(xì)胞，按1.2.3分為Con組和H/R組。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，裂解細(xì)胞，將裂解液3 500 r/min離心10 min。取上清液，分別利用MDA、SOD和GSH-Px試劑盒檢測上清液MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞分組同1.2.5。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測各組細(xì)胞凋亡。

1.2.7Western印跡檢測PRMT5和凋亡相關(guān)蛋白 細(xì)胞分組同1.2.5。各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，將細(xì)胞中總蛋白用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)試劑進(jìn)行提取。經(jīng)二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分離。將分離蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封閉處理，用4℃冰箱中分別用PRMT5(1∶1 000)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2(1∶2 000)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax,1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000)孵育過夜。洗膜，室溫條件下用羊抗兔二抗孵育2 h。加顯影液顯影，曝光拍照，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8雙熒光素酶報告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn) 接種H9c2細(xì)胞至6孔板，接種密度為2×105個/孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合為一層時，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PRMT5與miR-NC或miR-322-5p mimics、MUT-PRMT5與miR-NC或miR-322-5pmimics，轉(zhuǎn)染時間6 h。收集細(xì)胞并裂解，離心(半徑10 cm、3 500 r/min、10 min)。取20 μl上清液，向其中加100 μl 1×螢火蟲或海腎熒光素酶反應(yīng)工作液，混合均勻后，檢測螢火蟲和海腎的熒光強(qiáng)度。以螢火蟲與海腎熒光強(qiáng)度的比值表示細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-322-5p和PRMT5在H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2中的表達(dá) miR-322-5p在H/R組H9c2細(xì)胞中的含量較Con組顯著降低(0.43±0.04 vs 1.00±0.05，t=26.706，P<0.05)。H/R組H9c2細(xì)胞中PRMT5 mRNA和蛋白含量較Con組均顯著升高(mRNA：3.41±0.32 vs 1.00±0.06，t=22.207，P<0.05；蛋白：0.84±0.07 vs 0.41±0.04，t=16.000，P<0.05；)，見圖1。

圖1 PRMT5蛋白在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)

2.2過表達(dá)miR-322-5p對H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 miR-322-5p在轉(zhuǎn)染miR-322-5pmimics的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量為(2.58±0.16)，較轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞中的表達(dá)量(1.00±0.03)顯著升高(t=29.118，P<0.05)，說明過表達(dá)miR-322-5p的H9c2細(xì)胞構(gòu)建成功。與Con組相比，H/R組H9c2細(xì)胞中MDA含量顯著增多，SOD和GSH-Px活性較Con組均顯著降低(P<0.05)；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-322-5p組H9c2細(xì)胞中MDA含量顯著減少，SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，見表1。說明H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R處理后，細(xì)胞抗氧化能力減弱；過表達(dá)miR-322-5p減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化損傷。

表1 過表達(dá)miR-322-5p對H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的影響

2.3過表達(dá)miR-322-5p對H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 與Con組相比，H/R組H9c2細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達(dá)量顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-322-5p組H9c2細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達(dá)量顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見表1，圖2，圖3。說明經(jīng)H/R處理后凋亡加劇，而過表達(dá)miR-322-5p減少H/R處理的H9c2細(xì)胞凋亡。

圖2 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4敲減PRMT5對H/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激的影響 PRMT5蛋白在si-PRMT5的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量為0.20±0.02，較轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞中的表達(dá)量(0.41±0.04)顯著降低(t=14.087，P<0.05)，說明敲減PRMT5的H9c2細(xì)胞構(gòu)建成功，見圖4。H/R組H9c2細(xì)胞中MDA含量較Con組增多，SOD和GSH-Px活性較Con組均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；H/R+si-PRMT5組H9c2細(xì)胞中MDA含量較H/R+si-NC組降低，SOD和GSH-Px活性較H/R+si-NC組均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。說明心肌細(xì)胞H9c2經(jīng)H/R處理后細(xì)胞抗氧化能力減弱，敲減PRMT5可減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷。

圖3 細(xì)胞凋亡流式圖

圖4 轉(zhuǎn)染si-PRMT5的H9c2細(xì)胞中PRMT5蛋白表達(dá)

表2 敲減PRMT5對H/R誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響

2.5敲減PRMT5表達(dá)對H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響 與H/R+si-NC組相比，H/R+si-PRMT5組H9c2細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達(dá)量較H/R+si-NC組降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量較H/R+si-NC組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖5，圖6。說明H9c2細(xì)胞經(jīng)H/R處理后凋亡加劇，敲減PRMT5減少H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。

圖5 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖6 細(xì)胞凋亡流式圖

2.6miR-322-5p靶向調(diào)控PRMT5的表達(dá) PRMT5的3′UTR序列與miR-322-5p互補(bǔ)的位點(diǎn)見圖7。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PRMT5與miR-322-5pmimics的H9c2細(xì)胞熒光素酶活性為(0.41±0.04)，較共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-PRMT5與miR-NC的細(xì)胞熒光素酶活性(1.00±0.06)顯著下降(t=24.545，P<0.05)；共轉(zhuǎn)染MUT-PRMT5與miR-322-5p mimics的H9c2細(xì)胞熒光素酶活性為(0.99±0.05)，與共轉(zhuǎn)染MUT-PRMT5與anti-miR-NC的細(xì)胞熒光素酶活性(0.97±0.07)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.697，P=0.496)。PRMT5蛋白在轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimics的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞顯著降低(0.21±0.02vs 0.43±0.04，t=14.758，P<0.05)，PRMT5蛋白在轉(zhuǎn)染anti-miR-322-5p mimics的H9c2細(xì)胞中的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的細(xì)胞顯著升高(0.84±0.08 vs 0.42±0.04，t=14.087，P<0.05)，見圖8。說明miR-322-5p靶向結(jié)合并負(fù)調(diào)控PRMT5的表達(dá)。

圖7 PRMT5的3′UTR中含有與miR-322-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖8 miR-322-5p對H9c2細(xì)胞中PRMT5蛋白表達(dá)的影響

2.7上調(diào)PRMT5逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-322-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的作用 H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組細(xì)胞中PRMT5蛋白表達(dá)量、MDA含量、細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)量較H/R+miR-322-5p+pcDNA組均升高，SOD和GSH-Px活性和Bcl-2蛋白表達(dá)量較H/R+miR-322-5p+pcDNA組均降低(P<0.05)。見圖9，表3，圖10。說明上調(diào)PRMT5可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-322-5p對H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用。

圖9 各組細(xì)胞凋亡流式圖

表3 上調(diào)PRMT5逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-322-5p對H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的作用

1，2：H/R+miR-322-5p+pcDNA組、H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組圖10 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

研究表明，miRNA在治療不可逆心血管疾病(如AMI)以及修復(fù)/再生細(xì)胞療法的研究方面取得了進(jìn)展〔10〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-322-5p在肺動脈高壓模型大鼠的右心室表達(dá)減少〔4〕，并可緩解炎癥損傷〔6〕。miR-322/503的表達(dá)在MIRI過程中減少，miR-322/503的過表達(dá)通過上調(diào)p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)，減少梗死面積，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖〔11〕。還有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染心臟祖細(xì)胞(CPCs)產(chǎn)生的胞外體miR-322(CPCexo-322)可通過增強(qiáng)梗死心臟邊緣區(qū)的血管生成，保護(hù)心臟梗死〔12〕。本研究結(jié)果說明過表達(dá)miR-322-5p可減輕H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激，并減少細(xì)胞凋亡，miR-322-5p對H/R誘導(dǎo)的心肌發(fā)揮保護(hù)作用。

PRMT5是組蛋白和非組蛋白上精氨酸殘基對稱二甲基化的主要酶，調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞從基因表達(dá)調(diào)節(jié)到細(xì)胞增殖和分化的許多生物學(xué)過程，PRMT5被認(rèn)為是多種疾病的治療靶點(diǎn)，包括傳染病、心臟病和癌癥〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)，PRMT5在心臟中高度表達(dá)，是心肌肥厚信號的重要調(diào)節(jié)因子，PRMT5的過度表達(dá)顯著抑制苯腎上腺素刺激心肌細(xì)胞GATA4的乙?；托募》屎穹磻?yīng)，而PRMT5的敲除則誘導(dǎo)GATA4的活化和心肌細(xì)胞肥大，激活心臟中PRMT5的表達(dá)可能是預(yù)防心肌肥厚和心力衰竭的潛在治療方法〔14〕。本研究驗(yàn)證了PRMT5在心肌細(xì)胞H/R損傷中的作用。此外，本研究結(jié)果提示miR-322-5p通過靶向下調(diào)PRMT5的表達(dá)來阻礙H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡。

綜上，miR-322-5p是H/R處理的大鼠心肌細(xì)胞H9c2中表達(dá)下調(diào)的miRNA，過表達(dá)miR-322-5p可通過靶向下調(diào)PRMT5抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，這提示miR-322-5p有望成為心肌細(xì)胞MIRI損傷分子治療的靶點(diǎn)。