宋建治 徐禮森

(武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430022)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種全身性自身免疫性疾病，以滑膜內(nèi)膜明顯增生為特征，伴有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎癥〔1,2〕。RA是一種慢性疾病，會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷和功能障礙，并給患者帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)〔3,4〕。RA的生物學(xué)發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚。微小RNA(miRNA)在人類多種疾病中的重要調(diào)控功能已得到肯定，包括RA〔5,6〕，但仍有部分新發(fā)現(xiàn)的miRNA的功能需要探索。miR-1277-5p是一種近期在RA中發(fā)現(xiàn)的失調(diào)miRNA，其在RA中的功能尚未十分清楚。研究表明，含clip結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶(UBASH)3A在多種自身免疫性疾病中起著關(guān)鍵作用，包括RA〔7〕。但是UBASH3A在RA中的功能及與miR-1277-5p之間的關(guān)系尚未清楚。本研究旨在探討miR-1277-5p、UBASH3A在RA中的功能及關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1～10月武漢市第一醫(yī)院確診的RA關(guān)節(jié)置換術(shù)患者3例，意外事故導(dǎo)致的截肢或關(guān)節(jié)粉碎的患者2例?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?。胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司；杜氏細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)購自上?；鄯f生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8購自日本同仁化學(xué)研究所；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自上海宇玫博生物。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分離培養(yǎng) 參照彭菲菲等〔8〕的方法，將正?；そM織和RA滑膜組織采用組織塊和酶消化法分離正常滑膜細(xì)胞和RA滑膜細(xì)胞，分別標(biāo)記為正常組和RA組。將細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基(10% FBS)進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)、傳代，用5～7代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 將分離培養(yǎng)的RA滑膜細(xì)胞標(biāo)記為RA組、對(duì)照組，并將其隨機(jī)分為miR-NC組、miR-1277-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-1277-5p組、pcDNA組、pcDNA-UBASH3A組、si-NC組、si-UBASH3A組、miR-1277-5p+pcDNA組、miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A組、anti-miR-1277-5p+si-NC組、anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A組。各組細(xì)胞均按1：3的量加入脂質(zhì)體將相應(yīng)的質(zhì)?；駾NA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-1277-5p組(轉(zhuǎn)染miR-1277-5p mimics)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-1277-5p組(轉(zhuǎn)染anti-miR-1277-5p)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pcDNA-UBA-SH3A組(轉(zhuǎn)染pcDNA-UBASH3A)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-UBASH3A組(轉(zhuǎn)染si-UBASH3A)、miR-1277-5p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-1277-5p mimics和pcDNA)、miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A組(共轉(zhuǎn)染miR-1277-5p mimics和pcDNA-UBASH3A)、anti-miR-1277-5p+si-NC組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-1277-5p和si-NC)、anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A組(共轉(zhuǎn)染anti-miR-1277-5p和si-UBASH3A)，轉(zhuǎn)入RA滑膜細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，用qRT-PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3qRT-PCR 收集待檢測(cè)的細(xì)胞，提取總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存、備用。用qRT-PCR試劑盒檢測(cè)樣本中的miR-1277-5p、UBASH3A mRNA表達(dá)。結(jié)果以U6、GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-1277-5p、UBASH3A的表達(dá)水平。miR-1277-5p上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGAAATATATATATATATGT-3′，下游引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；UBASH3A上游引物5′-GGA CTTGCACGACTAA-3′， 下游引物5′-CCGT-ACGTCAATTGAC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCG T-3′；GAPDH上游引物5′-CTCTGCTCCTCCTGTTC GAC-3′，下游引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。

1.2.4Western印跡實(shí)驗(yàn) 將需要檢測(cè)的細(xì)胞裂解、提取總蛋白并定量和變性，用上清液進(jìn)行蛋白電泳上樣。用5%的分離膠和8%的濃縮膠進(jìn)行電泳，再用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，最后用2.5%脫脂奶粉封閉2 h。行一抗(1∶1 500)4℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。用超敏電化學(xué)(ECL)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影曝光。以目的條帶灰度與內(nèi)參條帶灰度的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5CCK-8實(shí)驗(yàn) 將需要檢測(cè)的細(xì)胞調(diào)整至105個(gè)/ml，按照CCK-8試劑盒要求操作，取適量細(xì)胞加入CCK-8溶液反應(yīng)，終止反應(yīng)后，在490 nm波長下檢測(cè)細(xì)胞吸光度(A)。細(xì)胞增殖率為A490樣本/A490對(duì)照×100%。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù) 先將需要檢測(cè)的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，重懸，再用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞懸浮。然后按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒要求操作，加入Annexin V-FITC、PI，避光反應(yīng)15 min，結(jié)束后，快速上流式細(xì)胞儀進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)分析。細(xì)胞凋亡率為Annexin V-FITC陽性率與PI陽性率之和。

1.2.7生物信息學(xué)預(yù)測(cè) 使用生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站mircode(http://mircode.org/)和StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn)預(yù)測(cè)與UBASH3A存在結(jié)合位點(diǎn)的miRNA，從中篩選保守的miRNA。另一方面結(jié)合NCBI中上傳的RA相關(guān)的差異miRNA表達(dá)譜分析，確定miRNA。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 首先通過化學(xué)合成野生型UBASH3A片段(UBASH3A-WT)和突變型UBASH3A片段(UBASH3A-MUT)，再將其克隆至psiCHECK2載體，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體并提取質(zhì)粒。用8倍質(zhì)粒量的脂質(zhì)體將miR-NC、miR-1277-5p、anti-miR-NC、anti-miR-1277-5p分別與psiCHE CK2-UBASH3A-WT、psiCHECK2-UBASH3A-MUT共轉(zhuǎn)染48 h。用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所處理細(xì)胞的熒光素酶活性。測(cè)量螢火蟲熒光素酶的活性(F)，在測(cè)量海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度(R)，結(jié)果以二者的比值(R/F)表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用PEMS3.2軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。GraphPad Prism6.0進(jìn)行相關(guān)圖片的繪制。

2 結(jié) 果

2.1各組miR-1277-5p、UBASH3A水平比較 與對(duì)照組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞相比，RA組關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中miR-1277-5p表達(dá)水平明顯降低，UBASH3A mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。見圖1和表1。

2.2miR-1277-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控 與miR-NC組相比，miR-1277-5p組RA滑膜細(xì)胞miR-1277-5p mRNA表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞增殖率明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、凋亡抑制蛋白(XIAP)表達(dá)水平明顯降低，P16、裂解DNA修復(fù)酶(cleaved-PARP)蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1277-5p組RA滑膜細(xì)胞miR-1277-5p mRNA表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞增殖率明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，PCNA、XIAP蛋白表達(dá)水平明顯升高，P16、cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2、圖3。

圖1 UBASH3A在RA滑膜細(xì)胞中表達(dá)

表1 各組miR-1277-5p、UBASH3A表達(dá)

圖2 miR-1277-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞凋亡的調(diào)控

表2 miR-1277-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的影響

1～5：對(duì)照組,miR-NC組，miR-1277-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-1277-5p組圖3 RA滑膜細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.3miR-1277-5p靶向UBASH3A 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果見圖4，miR-1277-5p與UBASH3A之間存在連續(xù)的7個(gè)核苷酸互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。與miR-NC組相比，miR-1277-5p組UBASH3A-WT細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1277-5p組UBASH3A-WT細(xì)胞熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)。miR-1277-5p負(fù)向調(diào)控UBASH3A蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。見圖5和表3。

圖4 miR-1277-5p與UBASH3A之間的結(jié)合位點(diǎn)

1～4：miR-NC組，miR-1277-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-1277-5p組圖5 miR-1277-5p調(diào)控UBASH3A蛋白表達(dá)

表3 miR-1277-5p直接調(diào)控

2.4UBASH3A對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控 與pcDNA組相比，pcDNA-UBASH3A組RA滑膜細(xì)胞UBASH3A mRNA表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞增殖率明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，PCNA、XIAP蛋白表達(dá)水平明顯升高，P16、cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與si-NC組相比，si-UBASH3A組RA滑膜細(xì)胞UBASH3A mRNA表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞增殖率明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，PCNA、XIAP蛋白表達(dá)水平明顯降低，P16、cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖6、表4、圖7。

圖6 UBASH3A處理的RA滑膜細(xì)胞凋亡

表4 UBASH3A對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控

1～4：pcDNA組，pcDNA-UBASH3A組，si-NC組，si-UBASH3A組圖7 UBASH3A處理的RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5過表達(dá)UBASH3A部分逆轉(zhuǎn)miR-1277-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的作用 與miR-1277-5p+pcDNA組相比，miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A組RA滑膜細(xì)胞miR-1277-5p mRNA表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞增殖率明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，PCNA、XIAP蛋白表達(dá)水平明顯升高，P16、cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見圖8、圖9、表5。

圖8 過表達(dá)UBASH3A和miR-1277-5p處理的RA滑膜細(xì)胞凋亡圖

1，2：miR-1277-5p+pcDNA組,miR-1277-5p+pcDNA-UBASH3A組圖9 Western印跡檢測(cè)PCDNA、P16、XIAP、cleaved-PARP水平

表5 過表達(dá)UBASH3A部分逆轉(zhuǎn)miR-1277-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控

2.6抑制UBASH3A逆轉(zhuǎn)anti-miR-1277-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的作用 與anti-miR-1277-5p+si-NC組相比，anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A組RA滑膜細(xì)胞miR-1277-5p mRNA表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞增殖率明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高，PCNA、XIAP蛋白表達(dá)水平明顯降低，P16、cleaved-PARP蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見表6、圖10、圖11。

表6 抑制UBASH3A逆轉(zhuǎn)anti-miR-1277-5p對(duì)RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡的作用

圖10 抑制UBASH3A和miR-1277-5p處理的RA滑膜細(xì)胞凋亡

1，2：anti-miR-1277-5p+si-NC組,anti-miR-1277-5p+si-UBASH3A組圖11 抑制UBASH3A和miR-1277-5p處理的RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白電泳

3 討 論

研究證實(shí)miRNA在RA中具有重要作用〔5,9〕。Crowe等〔10〕報(bào)道，miR-1277-5p是人骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞中異常下調(diào)的miRNA之一。Wang等〔11〕研究顯示，miR-1277-5p可同時(shí)靶向長鏈非編碼RNA X失活特異性轉(zhuǎn)錄本(XIST)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-13和血小板反應(yīng)蛋白1型基序5的ADAM金屬肽酶(ADAMTS5)參與OA發(fā)展，具體為XIST通過在OA中起miR-1277-5p的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)的作用來促進(jìn)MMP-13和ADAMTS5表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解。本研究結(jié)果說明miR-1277-5p在RA滑膜細(xì)胞的增殖、凋亡中具有關(guān)鍵作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-1277-5p還可靶向UBASH3A，這可能與miR-1277-5p在RA中的功能具有聯(lián)系。研究在韓國和歐洲人群中通過全基因組分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的RA易感基因(UBASH3A和SYNG-R1)〔12〕。Liu等〔13〕研究中也報(bào)道，UBASH3A與RA患者的疾病嚴(yán)重程度具有緊密相關(guān)性。Yang等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，RA患者的 外周血單核細(xì)胞(PBMC)中UBASH3A的mRNA表達(dá)異常增加，揭示UBASH3A失調(diào)可能與RA的發(fā)病有關(guān)，并且UBASH3A基因多態(tài)性(rs1893592和rs3788013)可能導(dǎo)致中國漢族人群RA的易感性。本研究結(jié)果說明UBASH3A在RA中的失調(diào)，確實(shí)具有促進(jìn)RA病情發(fā)展的作用；UBASH3A能夠恢復(fù)miR-1277-5p在RA滑膜細(xì)胞增殖、凋亡中的作用。這些結(jié)果為miR-1277-5p、UBASH3A在RA中的功能探索奠定基礎(chǔ)。