梁媛 郭霞 劉吉娜 趙雷 郝然 曹靜 張淑君

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河北 承德 067000；2河北大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科)

感音神經(jīng)性耳聾是導致患者聽覺損傷的常見類型，患者出現(xiàn)聽力障礙，對人們的日常生活帶來嚴重的影響。感音神經(jīng)性聾是因為機體聽神經(jīng)、內(nèi)耳、聽覺中樞發(fā)生器質性病變，對聲音感受、分析起到一定的阻礙作用，導致聽力減退，嚴重的會導致聽力完全喪失〔1〕。目前臨床中主要通過擴血管藥物進行治療感音神經(jīng)性聾，有助于內(nèi)耳血流量提高，對血管痙攣也起到改善作用〔2〕，但是治療效果不明顯。Liu等〔3〕研究指出，5-磷酸二酯酶(PDE5)蛋白在耳蝸中顯示高表達，提示在聽覺損傷方面PDE5抑制劑具有潛在治療價值。他達那非屬于一種選擇性的PDE5抑制劑，能有效提高機體血液中環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、一氧化氮(NO)水平，在選擇性擴張肺血管方面發(fā)揮著重要作用〔4〕。目前關于他達那非治療感音神經(jīng)性聾相關研究較少。本研究探討不同濃度他達那非對感音神經(jīng)性聾豚鼠模型聽力損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取60只健康雄性豚鼠，鼠齡2個月，體重220～300 g，均由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(冀)2018-008。所有豚鼠耳廓反射靈敏，均在室溫22℃、濕度50%的安靜環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2實驗方法

1.2.1感音神經(jīng)性聾豚鼠模型建立及分組 60只豚鼠中隨機選取12只為正常組，其余48只參考文獻〔5〕建立感音神經(jīng)性聾模型：采用40 mg/kg戊巴比妥鈉對48只豚鼠給予腹腔麻醉，無菌條件下在豚鼠顱頂雙側皮質聽區(qū)，通過硬膜手術將不銹鋼絲慢性電極植入其中，牙科水泥固定1 w，將每只豚鼠單籠飼養(yǎng)，在暴露倉中，白噪音為20～2 000 Hz，通過擴音器(GY型400W)放大，通過揚聲器在暴露倉中播放，頻率分析儀(B&K 2107型)完成連續(xù)監(jiān)測，暴露聲壓級110 dB，1次/d，每次持續(xù)1.5 h，連續(xù)干預1 w。正常組只做不銹鋼絲慢性電極植入手術。48只模型豚鼠隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各12只。豚鼠對外界聲刺激無反應，耳廓無抖動，耳反射完全消失，耳廓下垂，說明模型建立成功。

1.2.2藥物干預 待模型建立成功后，正常組和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，低、中、高劑量組給予他達那非(分別為0.1、1.0、2.0 mg/kg生理鹽水稀釋)腹腔注射，1次/d。各組豚鼠連續(xù)干預4 w。

1.2.3耳廓豎立、耳動反射檢查 模型建立后，各組豚鼠均在距離其30 cm位置用力擊掌，觀察各組耳廓豎立、抖動等狀況，擊掌5次，每次間隔2 s，在安靜無雜音的環(huán)境中進行，全程錄像記錄實驗數(shù)據(jù)。評估標準：①豚鼠耳廓無抖動，耳反射完全消失為(-)；②豚鼠耳廓有微弱抖動，耳反射閾值有明顯提高為(+)；③豚鼠耳廓有明顯的抖動，耳反射閾值有提高為()；④豚鼠耳廓抖動靈敏，耳反射閾值無變化為()。

1.2.4聽性腦干反應(ABR)閾值、Ⅰ波潛伏期檢查 在豚鼠清醒狀態(tài)下將其關在隔音電屏蔽室中，對豚鼠顱頂部位電極進行記錄，選擇豚鼠同側及對側乳突部位置入?yún)⒖己徒拥仉姌O。參考數(shù)值設置：濾波帶30～3 000 Hz，1 024次疊加，掃描15 ms，方波脈沖刺激0.1 ms，頻率為20 Hz，統(tǒng)計各組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期數(shù)據(jù)。

1.2.5氧化應激、炎癥因子相關指標檢測 抽取豚鼠腹部靜脈血3 ml，以3 000 r/min離心速度，離心處理10 min后，分離上層血清。采用硫代巴比妥酸檢測丙二醛(MDA)水平；采用黃嘌呤氧化酶反應檢測超氧化物歧化酶(SOD)水平；采用催化左旋精氨酸(L-Arg)和分子氧反應產(chǎn)生NO，與親核性物質形成有色化合物，在530 nm波長下計算誘導型一氧化氮合酶(iNOS)濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平：將提前稀釋好的標準品100 μl加入相應的微孔板反應空中，第1孔只加樣品稀釋液為零孔。蓋上模板混合均勻，在37℃下處理90 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；將準備好的抗體加入到每孔中0.1 ml，在37℃下處理60 min，底物四甲基聯(lián)苯胺(TMS)空白孔不加；甩去孔內(nèi)液體，每孔中加滿0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，浸泡1～2 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光處理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS終止液，即藍色變?yōu)辄S色。在波長450 mm處分析IL-6、TNF-α水平。

1.2.6耳蝸組織病理學觀察 處死豚鼠，在枕骨大孔處解剖后快速提取耳蝸組織制作標本，將其置于4%的多聚甲醛中進行固定，制作常規(guī)石蠟切片，在濃度0.5%蘇木素-伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進行脫水處理，最后用中性樹膠進行封片。

1.2.7Notch2、hes1蛋白表達檢測 采用Western印跡檢測，將采集到的血液標本10 000 r/min離心處理10 min，對上清液進行提取后，二喹啉甲酸(BCA)進行蛋白定量檢測，在2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉膜，取膜，4℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(Notch2、hes1一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時間為5 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS20.0軟件行方差分析、t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組豚鼠耳廓豎立、耳動反射比較 正常組聽覺及耳動反射表現(xiàn)為()，經(jīng)過外界聲刺激耳廓豎起。模型組經(jīng)過外界聲刺激，耳廓表現(xiàn)為無抖動，無反射，耳廓下垂，耳動反射為(-)。低劑量組經(jīng)過外界聲刺激耳廓抖動較弱，耳動反射為(+)，耳廓下垂；中劑量組經(jīng)過外界聲刺激耳廓有抖動，耳動反射為()，耳廓半豎起半下垂；高劑量組經(jīng)過外界聲刺激耳廓明顯抖動，耳動反射為()，耳廓豎起，下垂不明顯。見圖1。

2.2各組豚鼠ABR閾值、Ⅰ波潛伏期比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組ABR閾值、Ⅰ波潛伏期降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 各組豚鼠耳廓豎立情況比較

表1 各組豚鼠ABR閾值、Ⅰ波潛伏期、氧化應激及炎癥因子相關指標比較

2.3各組豚鼠氧化應激及炎癥因子相關指標比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組SOD水平降低，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組SOD水平升高，iNOS、MDA、IL-6、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4各組豚鼠耳蝸組織病理學觀察 正常組耳蝸組織未見淋巴積水，前庭膜完整、平直，鼓階、前庭階、蝸管結構完整。模型組耳蝸組織出現(xiàn)不同程度的積水，前庭階方向隆起擴張，有前庭膜發(fā)生破裂。低劑量組、中劑量組、高劑量組積水程度均有不同程度的緩解，其中中劑量組前庭膜膨隆程度較輕，高劑量組淋巴積水消失，前庭膜正常，病理學狀況得到明顯改善。見圖2。

圖2 各組耳蝸組織病理學觀察(HE染色，×200)

2.5各組Notch2、hes1蛋白表達比較 與正常組相比，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組Notch2、hes1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與中劑量組相比，高劑量組Notch2、hes1蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組Notch2、hes1蛋白表達比較

圖3 各組Notch2、hes1蛋白表達

3 討 論

感音神經(jīng)性聾屬于一種常見的聽力損傷疾病，其發(fā)病原因是因為耳蝸中的毛細胞被損害，堅持早發(fā)現(xiàn)、早治療，能最大程度地恢復患者聽力〔6〕。豚鼠與其他實驗動物相比具有發(fā)達的神經(jīng)系統(tǒng)，對聲音的敏感性較高，一方面試因為豚鼠為大耳廓，聽覺耳動反射較為明顯；另一方是豚鼠的耳蝸結構與人有共同之處，通過解剖能得到完整的耳蝸〔7，8〕，因此本文研究選擇豚鼠作為研究動物。

本研究結果提示，高濃度他達那非對豚鼠形態(tài)學變化起到一定的保護作用。ABR屬于一種神經(jīng)源性電活動，在聽力測試中被廣泛應用，能清晰地顯示各波段的起源，常被用來診斷聽覺損傷〔9〕。相關研究證實，短聲會導致ABR耳蝸底回，短聲引起的低頻刺激會導致毛細胞產(chǎn)生Ⅰ波，一旦發(fā)生損傷，行波會出現(xiàn)延遲，與耳蝸鋪片底回尤其是鉤端毛細胞嚴重損傷有關〔10，11〕。本研究結果提示，高濃度他達那非能減輕對豚鼠耳蝸毛細胞損傷，對其聽覺起到一定的保護作用。

MDA是膜脂過氧化過程中產(chǎn)生的主要產(chǎn)物，其水平大量增加會導致細胞膜發(fā)生損傷，臨床中常用來反映膜脂過氧化過程損傷程度〔12〕。SOD屬于一種抗氧化酶，在機體中廣泛存在，其生理活性特殊，對機體中的自由基有清除作用，常用SOD含量反映機體受自由基攻擊的嚴重程度〔13〕?；钚匝?ROS)是氧氣正常代謝的產(chǎn)物，在其信號轉導過程中NO、過氧化氫等發(fā)揮著重要作用。他達那非對加內(nèi)皮型NO釋放有一定的促進作用，對內(nèi)皮細胞功能有一定的改善作用〔14〕。本研究中他達那非干預后，豚鼠氧化應激反應被抑制，呈現(xiàn)濃度依賴。Shin等〔15〕研究指出，噪音誘導耳蝸損傷，IL-6在螺旋神經(jīng)節(jié)、側壁細胞中發(fā)揮著重要作用。目前已經(jīng)有研究證實，IL-6能對急性耳蝸損傷有誘導作用〔16〕。TNF-α會促進促炎細胞在耳蝸組織中大量累積〔17〕。本研究證實，高劑量他達那能明顯抑制感音神經(jīng)性聾豚鼠模型炎癥反應。

Notch蛋白主要存在于細胞膜受體中，對基因轉錄有直接調節(jié)作用，通過對細胞分化信號、特化基因表達進行調控，保留細胞特化的潛力〔18〕。hes1屬于Notch信號通路下游中重要的效應因子，在耳蝸的發(fā)育中起到參與作用，對毛細胞的分化有調節(jié)功能〔19，20〕。Liu等〔21〕研究指出，hes1過表達會抑制毛細胞分化，從而發(fā)揮負性調節(jié)作用，Notch2/hes1信號通路在毛細胞損傷、修復過程中至關重要。本研究提示，通過調控Notch2/hes1信號通路，參與毛細胞損傷、修復過程，可修復豚鼠聽力損傷。

綜上，他達那非對感音神經(jīng)性聾豚鼠模型干預效果顯著，能改善豚鼠聽力，通過調控Notch2/hes1蛋白，抑制氧化應激反應及炎癥反應，對聽力損傷起到一定的修復作用。