欒海艷 周建基 張寶媛 劉明遠(yuǎn) 劉杰 李楠

(佳木斯大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

中國是患有糖尿病人數(shù)最多的國家之一，占全球24%，2017年糖尿病的發(fā)生率已達(dá)到11.2%，并呈現(xiàn)逐年上升趨勢〔1〕。糖尿病也是目前已知并發(fā)癥種類最多的一種疾病，其中最常發(fā)生的慢性并發(fā)癥是糖尿病腎病(DN)，據(jù)統(tǒng)計(jì)糖尿病患者中20%～40%會(huì)并發(fā)DN，且往往會(huì)發(fā)展成為終末期腎病(ESRD)，患者5年生存率<20%。到2030年，DN將成為世界第七大致死疾病?；颊卟粌H需要腎臟替代治療，還需治療比其他尿毒癥患者更多更嚴(yán)重的合并疾病，不但耗費(fèi)了大量衛(wèi)生醫(yī)療資源，也給患者本人及其家屬造成了沉重的心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本文旨在探討人工合成的多肽cSN50.1對糖尿病大鼠腎損傷的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象及分組 清潔級(jí)雄性純系SD大鼠，體重180～220 g，購于黑龍江省佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后分為兩組：正常對照組給予常規(guī)基礎(chǔ)飼料飲食，模型建造組給予含高脂高糖的特殊飼料飲食；喂養(yǎng)4 w后，模型建造組一次性腹腔注射2%鏈脲佐菌素(STZ，35 mg/kg，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)，正常對照組同時(shí)注射與模型建造組等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；并在72 h后測定兩組空腹血糖(FBG)水平；將符合血糖標(biāo)準(zhǔn)的大鼠(≥16.7 mmol/L)再分為模型對照組、cSN50.1低劑量組和cSN50.1高劑量組，均繼續(xù)給予含高脂高糖的特殊飼料喂養(yǎng)直至整個(gè)實(shí)驗(yàn)完成。而正常對照組仍繼續(xù)給予常規(guī)的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。

1.2給藥方案 從第9周起cSN50.1低劑量組、cSN50.1高劑量組分別給予15、30 mg/kg cSN50.1腹腔注射，2次/d；同時(shí)正常對照組和模型對照組注射等體積的生理鹽水，藥物干預(yù)持續(xù)4 w后進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.3留取標(biāo)本及檢測指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)完成后，計(jì)量各組24 h尿液，并采用全自動(dòng)生化儀檢測尿蛋白(UPr)和尿肌酐(UCr)等腎功能生化指標(biāo)，并計(jì)算UPr與UCr的比值。乙醚麻醉后，各組大鼠內(nèi)眥靜脈取血，采用全自動(dòng)生化儀檢測尿素氮(BUN)和FBG；大鼠處死后，稱量各組大鼠腎濕重和體重，計(jì)算腎指數(shù)(腎濕重/體重)；再分別取出兩腎，左腎于-80℃冰箱保存，采用RT-PCR技術(shù)檢測腎組織中纖維連接蛋白(FN)、Ⅰ 型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)、Collagen Ⅳ和內(nèi)參照β-actin的基因表達(dá)情況，各目的基因表達(dá)的相對含量采用目的基因與β-actin灰度值的比值表示，右腎用甲醛溶液浸泡固定后，石蠟包埋切片，采用蘇木素-伊紅(HE)染色技術(shù)檢測腎組織病理變化情況。

1.4試劑 多肽cSN50.1的合成由吉爾生化(上海)有限公司完成；STZ購于Sigma公司；FBG、BUN、UPr、UCr測試試劑盒購于南京建成生物工程研究所；FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ和β-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)兼合成。引物序列：FN正義：5′-CCCATCGACCAGTGCCAAGATTC-3′，反義：5′-TTCCTTCCAGCGACCCGTAGAG-3′；Collagen Ⅰ正義：5′-TTCT CCTGGCAAAGATGGACTCAAC-3′，反義：5′-GGGCTGCGGATGTTCTCAATCT-G-3′；Collagen Ⅳ正義：5′-ACTTCGCCTCCAGGAA CGACTAC-3′，反義：5′-GGGCACTTCTAAACT-CTTCCAGACAG-3′；β-actin正義：5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，反義：5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCA AA-3′。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組FBG水平和腎功能指標(biāo)比較 與正常對照組相比，模型對照組FBG、BUN、UPr、UCr及UPr/UCr顯著升高(P<0.01)；cSN50.1低劑量組、cSN50.1高劑量組較模型對照組均顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與正常對照組相比，cSN50.1低劑量組各指標(biāo)水平仍有顯著差異(P<0.01)，cSN50.1高劑量組FBG、BUN、UPr和UCr有顯著差異(P<0.01，P<0.05)，但UPr/UCr無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組FBG和腎功能水平比較

2.2各組腎指數(shù)比較 與正常對照組腎指數(shù)〔(5.45±0.47)×10-3〕相比，模型對照組〔(11.29±0.92)×10-3〕顯著升高(P<0.01)；cSN50.1低劑量組〔(9.47±1.66)×10-3〕較模型對照組明顯下降(P<0.05)，cSN50.1高劑量組〔(7.39±0.62)×10-3〕顯著下降(P<0.01)，但與正常對照組相比，cSN50.1低劑量組和高劑量組未恢復(fù)到正常水平，仍有顯著差異(均P<0.01)。

2.3各組腎組織病理變化情況 HE染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠腎組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰；而模型對照組腎組織中腎小球體積有所增大，局部腎小管出現(xiàn)腫脹壞死，并伴有空泡樣變性現(xiàn)象，系膜基質(zhì)也出現(xiàn)增多現(xiàn)象，此外還有炎性浸潤等病理損傷；與模型對照組比較，cSN50.1低劑量組和cSN50.1高劑量組大鼠腎組織病理損傷減輕，見圖1。

圖1 各組腎組織病理變化情況(HE染色，200 μm)

2.4各組腎組織中FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ基因表達(dá)比較 與正常對照組相比，模型對照組腎組織FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；cSN50.1低劑量組和cSN50.1高劑量組較模型對照組均顯著降低(P<0.01)，但與正常對照組相比，仍未恢復(fù)到正常水平，有明顯差異(P<0.01，P<0.05)，見表2，圖2。

表2 各組FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表達(dá)

1～4：正常對照組、模型對照組、cSN50.1低劑量組、cSN50.1高劑量組圖2 各組FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA表達(dá)

3 討 論

DN是一種發(fā)病機(jī)制紛繁復(fù)雜的慢性疾病，目前公認(rèn)與之發(fā)病相關(guān)的因素主要包括：基因遺傳、糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激刺激、炎癥反應(yīng)等〔2〕。其中，炎癥在DN中的作用已越來越得到大家關(guān)注，幾乎參與了DN發(fā)生發(fā)展的全過程〔3～5〕，因此，DN也可以被認(rèn)為是一種由糖脂代謝紊亂引發(fā)的炎癥性疾病〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖、高脂血癥和高胰島素血癥等代謝性因素均可通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活糖尿病患者腎組織內(nèi)的固有細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞)，引起這些細(xì)胞中的趨化因子、黏附因子、細(xì)胞因子等的表達(dá)增高，從而募集其他炎癥細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等)，而這些被募集到的炎性細(xì)胞又能釋放出更多的炎癥細(xì)胞因子去刺激腎小管上皮細(xì)胞，使腎小管上皮細(xì)胞繼續(xù)釋放出更多的炎癥介質(zhì)、趨化因子及細(xì)胞因子，形成惡性循環(huán)，使炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇，出現(xiàn)UPr，甚至使腎組織出現(xiàn)病理性改變，腎小球基膜增厚、硬化，腎小管間質(zhì)纖維化，最終逐漸進(jìn)展成終末期腎臟病〔7～9〕。

cSN50.1是一種人工合成的多肽，已被證實(shí)在由多病因引起的炎癥性疾病中具有較好的作用。研究發(fā)現(xiàn)，cSN50.1可以通過與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(importin)α和importin β結(jié)合，競爭性抑制應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(SRTFs)的入核轉(zhuǎn)運(yùn)，減少敗血癥小鼠血液、脾和肺的細(xì)菌負(fù)荷，降低血漿中促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，將cSN50.1與抗生素相結(jié)合還能明顯延長小鼠的平均生存時(shí)間〔10〕。此外，cSN50.1還可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子的入核轉(zhuǎn)運(yùn)，減輕低密度脂蛋白(LDL)受體缺乏小鼠的代謝炎癥，調(diào)控其膽固醇、三酰甘油和脂肪酸的合成，局部糾正脂質(zhì)代謝紊亂、高血糖癥、高膽固醇血癥、高脂血癥、脂肪沉滯性動(dòng)脈硬化癥和脂肪肝〔11〕。本研究結(jié)果提示腹腔注射cSN50.1能夠明顯降低2型糖尿病模型大鼠FBG、BUN、UPr、UCr及UPr/UCr水平，改善其血糖和腎功能異常情況；且cSN50.1還能使模型大鼠的腎指數(shù)下降，改善其腎臟肥大的情況；此外，cSN50.1還可以減輕模型大鼠腎組織的腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增多，腎小管腫脹壞死，炎性浸潤等病理損傷情況。

DN腎組織損傷的主要病理特征是腎小球基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)形成增多、細(xì)胞的足突消失，最終導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率(GFR)降低，UPr增加，腎小球和腎小管發(fā)生間質(zhì)纖維化〔12,13〕，而腎間質(zhì)纖維化也是其他慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎病的共同路徑〔14,15〕。研究發(fā)現(xiàn)，形成腎間質(zhì)纖維化的重要因素是細(xì)胞外基質(zhì)的合成降解失衡，腎小球和腎間質(zhì)內(nèi)大量積聚并沉積的細(xì)胞外基質(zhì)可引起腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生〔16,17〕。FN、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅳ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分〔18,19〕，隨著間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)的積累和小管基底膜破壞，F(xiàn)N、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅳ均出現(xiàn)過度表達(dá)現(xiàn)象，因此是評(píng)判腎纖維化程度的重要指標(biāo)〔20〕。本研究結(jié)果表明cSN50.1能夠降低糖尿病模型大鼠腎組織中致纖維化因子的表達(dá)水平，從而減輕大鼠腎組織的病理損傷程度。

綜上，cSN50.1對糖尿病大鼠的腎損傷具有一定保護(hù)作用，這可能與cSN50.1可降低大鼠腎組織中纖維化因子FN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅳ mRNA的表達(dá)有關(guān)。