李雅嘉 李卿慧 李強翔1， 劉蕾

(1湖南省人民醫(yī)院 湖南省老年醫(yī)學研究所，湖南 長沙 410008；2寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 寧夏老年疾病臨床研究中心；3中南大學湘雅醫(yī)院；4婁底市中心醫(yī)院)

冠心病、視網(wǎng)膜病變及腎動脈硬化等作為2型糖尿病的三大主要血管并發(fā)癥，其共同的病理學基礎涉及動脈的粥樣硬化性損害〔1〕。糖尿病患者發(fā)生的動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生早、進展快，然而其并未具備特殊的病理組織學特征。其中，內(nèi)皮功能紊亂在糖尿病血管病變及動脈硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了關鍵性作用。脂聯(lián)素被發(fā)現(xiàn)是一種具備調(diào)節(jié)糖與血脂代謝、保護血管功能、維護能量代謝平衡、逆轉(zhuǎn)血管病變等廣泛生理作用的脂肪細胞因子〔2〕，本研究在高糖環(huán)境下使用球形脂聯(lián)素(gAd)處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，觀察其對高糖環(huán)境下HUVEC增殖及血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 gAd (北京愛迪博生物科技有限公司購入)，臍靜脈內(nèi)皮細胞株(武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司購入)； 細胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術研究所)；低糖型DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)； 胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)； D-葡萄糖和胰蛋白酶粉末(美國Sigma 公司)； CO2培養(yǎng)箱(武漢華海公司)； 倒置生物顯微鏡(OLYMPUS 公司)；全自動酶標讀數(shù)儀(美國JB/TEK公司)； LDZX-40C 型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器(北京六一儀器廠)； KH-600DB 型數(shù)據(jù)超聲波清潔器(日本TOMY公司)；流式細胞儀(德國Biometra公司，PP3000型)。

1.2細胞培養(yǎng)傳代及實驗分組 培養(yǎng)細胞至生長達80%，棄去含血清培基，并更換無血清培基培養(yǎng)24 h。之后分別換成含不同濃度葡萄糖(5、10、15、20、25、30、35、40 mmol/L)的培養(yǎng)基，通過12、24、36、48、72 h 觀察后，確立臍靜脈內(nèi)皮細胞生長的最適高糖濃度為25 mmol/L。

實驗分組：對照組：含5.5 mmol/L葡萄糖；高糖(HG)組：含25 mmol/L葡萄糖；gAd組：含2.5 μg/ml gAd；HG+gAd組：含50 mmol/L葡萄糖+2.5 μg/ml gAd。VEGF ELISA試劑盒測定不同處理組臍靜脈內(nèi)皮細胞的上清液中VEGF的含量。

1.3噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖 HUVEC經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，消化，用含0.5% FBS 的M200 培養(yǎng)基制成細胞懸液。經(jīng)細胞計數(shù)，按每孔5×103/150 μl接種于96 孔板。全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h， 棄培養(yǎng)液，換上只含有0.5% FBS的培養(yǎng)基預處理24 h，以達到細胞同步化。分別加入對照組、gAd組、HG+gAd組和HG組培養(yǎng)基。繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)12、24、36、48、72 h 后，加入MTT 溶液50 μl，使用酶標儀按MTT比法法測定各孔490 nm 和690 nm 的吸光度(OD 值)。每組設3 個復孔，至少重復3次實驗。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0 軟件進行配對t檢驗。

2 結 果

2.1gAd影響高糖培養(yǎng)下HUVEC 增殖活性 與對照組比較，HG組及HG+gAd組明顯抑制了HUVEC增殖(P<0.05)，而gAd組明顯促進了HUVEC增殖(P<0.05)；與HG組比較，gAd組及HG+gAd組對HUVEC的增殖具有促進作用(P<0.05)，見表1。

表1 各組HUVEC增殖的影響

2.2ELISA測定gAd對高糖環(huán)境下VEGF蛋白含量的影響 相較于對照組，HG組上清液VEGF蛋白的含量明顯升高(P<0.05)，gAd組與HG+gAd組VEGF蛋白含量明顯降低(P<0.05)；與HG組比較，gAd組與gAd+HG組的VEGF含量明顯降低(P<0.05)。見表1。

3 討 論

研究顯示，血管內(nèi)皮細胞對維持血管的正常功能及血管新生有著重要作用，其中，血管內(nèi)皮細胞的增殖在血管新生過程中發(fā)揮了關鍵作用。內(nèi)皮細胞生長因子是一種特異性促血管化生長因子，其能參與促進新生內(nèi)皮細胞增殖、遷移和維持活性等多個環(huán)節(jié)〔3,4〕。在通常情況下，內(nèi)皮細胞VEGF維持較低水平表達，這一特征在維持血管內(nèi)皮細胞活性及血管結構完整性方面發(fā)揮了關鍵作用〔5〕。同時，有證據(jù)表明VEGF通過介導血管新生及誘發(fā)炎癥反應密切參與了糖尿病并發(fā)缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展，維持血管內(nèi)皮細胞中VEGF平衡是針對糖尿病血管并發(fā)癥的重要治療方向〔6,7〕。

脂聯(lián)素作為一種脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子，具備調(diào)節(jié)糖及脂肪代謝、保護血管、抑制血管新生及相關炎性反應的作用，且被證實能有效逆轉(zhuǎn)血管病變〔8〕。其對動脈粥樣硬化的治療已經(jīng)被廣泛研究且具備良好前景。gAd即脂聯(lián)素在體內(nèi)循環(huán)時存在全長脂聯(lián)素和經(jīng)蛋白水解成的C端球狀結構域，其具備較強生物學活性。

本研究通過提高HUVEC生長條件中葡萄糖水平，建立高糖誘導下HUVEC損傷細胞模型，較好地模擬了適宜HUVEC生存的高糖微環(huán)境。MTT實驗驗證了在高糖環(huán)境下gAd可逆轉(zhuǎn)高糖對HUVEC增殖的抑制作用。同時gAd可以下調(diào)HUVEC 中VEGF的表達，可以進一步抑制新生血管的生成及組織血管化進程。通過觀察gAd高糖環(huán)境下HUVEC的增殖的影響及機制，從而為糖尿病血管并發(fā)癥的治療提供實驗依據(jù)。