張麗 李飛

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462000)

帕金森病(PD)臨床表現(xiàn)主要有靜止性震顫、肌緊張增強(qiáng)、運(yùn)動遲緩、步態(tài)和姿勢障礙等運(yùn)動癥狀，并常常伴有情緒低落、焦慮、認(rèn)知障礙等非運(yùn)動癥狀〔1〕。目前，針對PD主要以補(bǔ)充多巴胺的藥物治療為主，但長期服用副作用日益加劇。PD發(fā)病病因尚未明確，但已有大量研究表明PD發(fā)病機(jī)制可能與腦內(nèi)出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)相關(guān)〔2，3〕。

百香果籽油是西番蓮屬植物——百香果加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，具有豐富的藥用和保健功效，可降壓降脂、抗焦慮、抗氧化〔4〕，但百香果籽油對PD是否有作用，目前鮮少報道。本課題組采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)建立PD小鼠模型，觀察百香果籽油對PD行為能力的影響，初步探討其作用機(jī)制，為開發(fā)百香果籽油的藥用價值和尋找治療PD的神經(jīng)保護(hù)藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠，雄性，SPF級，體重(20±2)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。

1.2分組 小鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為對照組、PD模型組、百香果籽油組，每組12只。

1.3儀器和試劑 石蠟切片機(jī)購于德國徠卡公司；Fluo View FV1200 激光共聚焦顯微鏡購于日本奧林巴斯公司；MPTP購自Sigma公司；兔抗鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酸(TH)、Toll樣受體(TLR)4和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB p65多克隆抗體均購于Abcam公司；羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記二抗和Cy3標(biāo)記二抗以及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均購于碧云天生物技術(shù)公司。

1.4百香果籽油的制備 從百香果中取百香果籽后去雜、洗凈、干燥粉碎，研磨，再加入8倍體積蒸餾水，充分?jǐn)嚢柚脸嗜橐籂睿? 500 r/min離心，取上清。上清中加適量飽和氯化鈉(NaCl)溶液，緩慢攪拌，靜置，待油水分層后收集上層油層，即獲得百香果籽油〔5〕。

1.5PD小鼠模型制備及動物給藥 PD模型組和百香果籽油組采用腹腔注射MPTP(30 mg/kg，連續(xù)7 d)，以建立PD小鼠模型，對照組于相同時間點(diǎn)腹腔注射等體積的生理鹽水。自建模第8天起，百香果籽油組灌胃百香果籽油100 mg/kg，1次/d，連續(xù)6 w。PD模型組和對照組在相同時間點(diǎn)灌胃等體積蒸餾水。

1.6轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的平衡和抓握能力 末次給藥24 h后，對各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察其平衡和抓握能力。

1.6.1轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 將小鼠置于轉(zhuǎn)棒儀的轉(zhuǎn)桿上，開始爬行后記錄小鼠在轉(zhuǎn)桿上的滯留時間。每只小鼠測定2次，2次測定時間間隔至少1 h。

1.6.2懸掛實(shí)驗(yàn) 首先將小鼠放在小鼠籠的蓋子上，輕搖籠蓋，使小鼠抓握籠蓋，然后將籠蓋倒置，記錄小鼠從籠蓋倒置到墜落的時間。每只小鼠測定2次，2次測定時間間隔至少1 h。

1.7取材及指標(biāo)檢測

1.7.1免疫組化觀察黑質(zhì)TH細(xì)胞數(shù)量變化 每組各取6只小鼠進(jìn)行心臟灌流、石蠟包埋，常規(guī)脫蠟脫水，抗原修復(fù)，避光孵育10 min，加入一抗(TH，1∶500)，4 ℃孵育過夜，加入二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，鏡檢。每張切片隨機(jī)選取5個黑質(zhì)視野，計數(shù)TH陽性細(xì)胞數(shù)量。

1.7.2免疫熒光染色觀察黑質(zhì)TLR4和NF-κB p65蛋白的表達(dá) 每組各取6只小鼠進(jìn)行心臟灌流，冰凍切片，經(jīng)過破膜、封閉后，加一抗(TLR4，1∶500；NF-κB p65，1∶500)過夜，二抗室溫孵育2 h，DAPI孵育5 min，封片，鏡檢。每張切片隨機(jī)選取5個黑質(zhì)視野，利用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測定積分光密度值(IOD)。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組行為能力比較 與對照組比較，PD模型組滯留和懸掛時間均明顯縮短(均P<0.05)；與PD模型組比較，百香果籽油組滯留和懸掛時間均明顯延長(均P<0.05)。見表1。

表1 各組行為學(xué)比較

2.2各組小鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)量比較 與對照組〔(74.28±5.25)/mm2〕比較，PD模型組黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)量〔(32.18±2.41)/mm2〕明顯減少；與PD模型組比較，百香果籽油組黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)量〔(46.84±2.76)/mm2〕明顯增加(均P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞表達(dá)(免疫組化，×200)

2.3各組黑質(zhì)TLR4和NF-κB p65蛋白的表達(dá)比較 免疫熒光染色顯示，被標(biāo)記上綠色熒光的為TLR4蛋白，主要表達(dá)在神經(jīng)元膜上；被標(biāo)記為紅色熒光的為NF-κB p65蛋白，主要表達(dá)在神經(jīng)元胞質(zhì)中。與對照組比較，PD模型組黑質(zhì)TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與PD模型組比較，百香果籽油組黑質(zhì)TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。見圖2、圖3和表2。

圖2 各組小鼠黑質(zhì)TLR4的表達(dá)(免疫熒光，×200)

圖3 各組小鼠黑質(zhì)NF-κB p65的表達(dá)(免疫熒光，×200)

表2 各組黑質(zhì)TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)比較值)

3 討 論

PD的臨床表現(xiàn)主要有靜止性震顫、肌緊張增強(qiáng)、運(yùn)動遲緩、步態(tài)和姿勢障礙等運(yùn)動癥狀。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)用于檢測小鼠協(xié)調(diào)運(yùn)動能力的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，懸掛實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的抓握能力，本研究結(jié)果表明，注射MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型能很好地模擬PD患者的運(yùn)動癥狀，說明模型制備成功。

PD主要的病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性，當(dāng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元受損后，會導(dǎo)致黑質(zhì)膽堿能神經(jīng)元功能亢進(jìn)，進(jìn)而出現(xiàn)運(yùn)動減少、動作遲緩等PD癥狀〔6〕。TH是兒茶酚胺合成的限速酶，多巴胺是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，因此TH的表達(dá)可以作為檢測PD的一項(xiàng)重要指標(biāo)〔7〕。

PD的發(fā)病原因雖然尚未明確，但已有研究表明PD和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切〔2〕。 TLR4 /NF-κB信號通路在誘導(dǎo)免疫/炎癥反應(yīng)及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病過程中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR屬于跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，其中TLR4是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要成員〔8〕。NF-κB是TLR4活化后信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵分子，是連接上下游信號的通道，p65是其最具代表性的活性亞基〔9〕。研究表明，當(dāng)機(jī)體受到刺激后，細(xì)胞膜上的TLR4識別相應(yīng)配體，經(jīng)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終活化NF-κB，誘導(dǎo)釋放大量的炎性因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)〔10〕。

綜上，百香果籽油可以改善MPTP誘導(dǎo)的PD模型小鼠的運(yùn)動障礙，其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激失衡，保護(hù)黑質(zhì)TH神經(jīng)元有關(guān)。具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究明確。