熊靜 邢維昊 李舒婷 張曉琳 劉鳳 巫曉宇

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650101)

癡呆已經(jīng)成為老年人群致死和致殘的主要疾病之一。中國現(xiàn)有癡呆患者約1 000萬，到2050年，癡呆患者預(yù)計達到4 000萬〔1，2〕。2型糖尿病(T2DM)是阿爾茨海默病(AD)和血管性癡呆的重要危險因素。T2DM患者AD發(fā)病率是非T2DM者的1.5倍，對老年人影響更為明顯〔3〕。T2DM 發(fā)病增加，加上年齡增長和肥胖的代謝后果，顯著增加了認知能力下降和癡呆的發(fā)病〔4〕。T2DM、肥胖和AD 存在著胰島素抵抗、腦小血管損傷、炎癥和氧化應(yīng)激等共同的病理生理機制〔5〕，但T2DM與認知損害之間的分子機制仍不清楚。近年來，連接大腦、內(nèi)分泌胰腺、脂肪組織的神經(jīng)信號通路功能障礙越來越受到重視〔6〕。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在哺乳動物腦內(nèi)含量豐富〔7〕，也存在于外周神經(jīng)、骨骼肌、平滑肌、肝臟、淋巴細胞、內(nèi)分泌系統(tǒng)、胰腺、內(nèi)皮細胞和脂肪組織中〔8〕。BDNF在學(xué)習和記憶中有重要的作用，與AD等神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)〔9〕。BDNF在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中先合成BDNF前體蛋白(proBDNF)，proBDNF在細胞內(nèi)和細胞外經(jīng)過一系列蛋白酶剪切形成成熟型BDNF(mature BDNF)〔7，10〕。研究表明，proBDNF和mature BDNF分別通過p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75NTR)和酪氨酸激酶受體(Trk)B結(jié)合，在學(xué)習和記憶中起相反的生物學(xué)作用〔7，9,10〕。

研究發(fā)現(xiàn)肥胖、T2DM、神經(jīng)變性疾病患者血清中BDNF基因表達水平降低〔11，12〕。T2DM損害學(xué)習和記憶的部分原因是通過下調(diào)BDNF表達，改變了突觸可塑性〔13〕。目前，還沒有研究報道T2DM對腦內(nèi)proBDNF水平或proBDNF與mature BDNF比值及其相應(yīng)的受體p75NTR和TrkB的影響。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)8周齡C57BL/6小鼠，建立T2DM模型，并持續(xù)到小鼠老年期，測定T2DM小鼠短期記憶和空間參考記憶損傷和腦內(nèi)proBDNF-p75NTR和mature BDNF-TrkB的表達。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8周齡C57BL/6雌性小鼠，分為T2DM組(n=8)和對照組(n=8)。T2DM組給予高脂飲食，對照組給予標準飲食，喂養(yǎng)30 w至小鼠38周齡。標準無菌條件，室溫22℃，濕度55%，12 h∶12 h光照-黑暗周期飼養(yǎng)。

1.2主要試劑和儀器 主要試劑：proBDNF和mature BDNF酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(澳大利亞南澳大學(xué)周新富教授贈送)，p75NTR ELISA試劑盒(美國R&D公司)，TrkB ELISA試劑盒(Sino Biological Inc.)，TRIzoL試劑盒(美國 Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒(美國 Qiagen公司)，引物(Invitrogen公司合成)。主要儀器：ABI 7300實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)。

1.3小鼠體重、空腹血糖、葡萄糖耐量測定(GTT)和胰島素耐量測定(ITT) 小鼠入組時測定基礎(chǔ)體重和空腹血糖，之后每周測量體重，每4周測量空腹血糖?？崭寡窃诮尺^夜16 h后，尾靜脈采血測定。小鼠38 w時，進行GTT和ITT。GTT在小鼠禁食16 h后進行，測量空腹血糖后給予腹腔內(nèi)注射葡萄糖(1 g/kg)，分別于注射后15、30、60、90、120 min重復(fù)測定。ITT在小鼠禁食5 h后進行，測定基線血糖后，給予胰島素腹腔注射(0.75 U/kg)，分別于注射后15、30、60、90和120 min重復(fù)測定。

1.4Y迷宮空間識別實驗和自發(fā)交替實驗 采用Y迷宮空間識別實驗和自發(fā)交替實驗測定小鼠的短期記憶。Y迷宮由3個完全相同的臂組成，形成Y形。中央處各有一個可移動的隔板。Y迷宮空間識別實驗步驟簡述如下：3個臂隨機設(shè)為新異臂、起始臂和其他臂。實驗的第1個階段(訓(xùn)練期)，用隔板擋住新異臂，開放起始臂和其他臂，將小鼠自起始臂放入，在兩個開放的臂中自由活動探索3 min。2 h后進行第2階段(回憶期)，打開新異臂，將小鼠自起始臂放入，在3個臂中自由活動3 min。Anymaze軟件記錄小鼠在各臂中的活動時間和進入次數(shù)，計算新異臂中活動時間的百分比，進入新異臂次數(shù)的百分比。3 d后進行Y迷宮自發(fā)交替實驗，測試前將Y迷宮旋轉(zhuǎn)45°，將小鼠自任意一臂中放入，自由活動5 min，Anymaze軟件記錄小鼠進入各個臂的順序和次數(shù)，計算自發(fā)交替百分比。

1.5Morris水迷宮實驗 用Morris水迷宮測試來測量空間參考記憶。水迷宮裝置由一個圓形聚丙烯池(直徑120 cm×高45 cm)，池周有4種不同圖案提示，以幫助小鼠定位。水溫保持在(23±1)℃，加入無毒的白色涂料使水不透明。第1天為適應(yīng)期，將小鼠平臺所在象限(目標象限)面向池壁放入水中，自行游泳2 min。第2天進行可見平臺實驗，使平臺露出水面0.5 cm，觀察小鼠分別從四個象限的某一固定點入水至爬上平臺的時間，小鼠若超過60 s找不到平臺，可引導(dǎo)其找到平臺。第3～6天進行定位航行實驗：將平臺隱入水下1 cm，再將小鼠面向并靠近池壁分別從四個不同象限入水，Anymaze軟件記錄小鼠從入水到爬上平臺的游泳時間(逃避潛伏期)和在目標象限內(nèi)的游泳時間。第7天進行空間探索實驗，移除平臺，給予小鼠60 s探索時間，Anymaze軟件記錄小鼠在原平臺所在位置區(qū)域的時間和穿越原平臺位置的次數(shù)。

1.6RT-PCR檢測小鼠腦組織BDNF、TrkB和p75NTR mRNA表達 采用CO2窒息法，人道處死小鼠，取出腦組織，液氮中速凍后貯存于-80℃冰箱備用。用TRIzoL試劑提取小鼠大腦總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR測定BDNF、p75NTR、TrkB基因在小鼠腦組織中的轉(zhuǎn)錄水平。RT-PCR的反應(yīng)程序為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，循環(huán)40次，60℃ 1 min，引物序列：BDNF正向：5′-TACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCC-3′，反向：5′-ACTTGACTACTGAGCA-TCACCCTG-3′；p75NTR正向：5′-GTGGGACAGA-GTCTGGGTGT-3′，反向：5′-AAGGAGGGGAGGTGATAGGA-3′；TrkB正向：5′-AGGGCAACCCGCCCACGGAA-3′，反向：5′-GGATCGGTCTGGGGAAAAG-3′；β-actin正向：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反向：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。RT-PCR檢測結(jié)果通過β-actin結(jié)果進行矯正，應(yīng)用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行分析〔14〕。

1.7ELISA測定小鼠腦組織proBDNF、成熟(mature)BDNF、TrkB和p75NTR蛋白 用放射免疫沉淀試驗(RIPA)蛋白裂解液提取腦組織蛋白。Mature BDNF ELISA測定〔14,15〕簡述如下：G蛋白純化的小鼠抗-mature BDNF單克隆抗體(工作濃度1 μg/ml)包被酶標板，37℃ 1 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板，3%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加樣：標準品為重組mature BDNF蛋白，倍比稀釋加入，范圍在0～2 000 pg/ml，加入腦組織樣本(濃度250 μg/ml)，37℃，1 h，PBST洗板，加入檢測抗體—生物素標記的羊抗mature BDNF抗體(工作濃度0.15 μg/ml)，37℃，1 h。PBST洗板，加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HRP)，37℃，1 h，PBST洗板，加入新鮮配制的TMB底物，室溫避光，10～15 min內(nèi)顯色。加入0.1 mol/L Hcl終止反應(yīng)，用Model 2550 EIA reader于450 nm讀取OD值。 ProBDNF測定步驟同mature BDNF〔15〕。包被抗體為G蛋白純化的羊抗-proBDNF單克隆抗體(工作濃度為5 μg/ml)，標準品為重組proBDNF蛋白，范圍在0～2 000 pg/ml，腦組織樣品濃度為250 μg/ml，檢測抗體為生物素標記的羊抗proBDNF抗體(工作濃度0.15 μg/ml)。P75NTR和TrkB測定按照試劑盒說明書進行。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立T2DM模型 T2DM組平均體重〔(54.36±2.68)g〕明顯高于對照組〔(23.66±1.62)g,t=11.40，P<0.01〕。T2DM組平均空腹血糖〔(8.22±0.41)mmol/L〕明顯高于對照組〔(4.45±0.22)mol/L,t=36.69，P<0.01〕。GTT實驗顯示，與對照組相比，T2DM組葡萄糖耐量受損，注射葡萄糖后血糖升高的峰值延遲，60 min達到峰值，之后緩慢下降，至注射后120 min時，血糖仍明顯高于對照組(P<0.01)。ITT中，與對照組相比，T2DM小鼠對胰島素的敏感性降低。T2DM組給予胰島素腹腔注射后，血糖水平降低的幅度更小，并且更快地開始恢復(fù)，注射胰島素后120 min，T2DM組血糖明顯高于對照組(P<0.05)。見表1、表2。

2.2Y迷宮實驗中T2DM組小鼠短期工作記憶下降 T2DM組在新異臂內(nèi)活動時間百分比、進入新異臂的次數(shù)占總次數(shù)百分比、自發(fā)交替率較對照組均明顯減少(P<0.05)。見表3。

表1 兩組GTT結(jié)果

表2 兩組ITT結(jié)果

表3 兩組Y迷宮結(jié)果

2.3Morris水迷宮測試中T2DM小鼠空間參考記憶下降 定位航行實驗顯示，隨著訓(xùn)練時間的延長，對照組逃跑潛伏期逐漸縮短，在目標象限的時間逐漸增加，T2DM組小鼠的比對照組小鼠長，在目標象限中的時間更短(P<0.05)。表明T2DM小鼠學(xué)習速度下降。見表4?？臻g探索試驗顯示，移除平臺后，T2DM小鼠在之前平臺所在區(qū)域的時間〔(1.73±0.04)s〕明顯少于對照組〔(1.93±0.04)s，P<0.05〕；T2DM小鼠進入之前平臺所在區(qū)域的次數(shù)〔(3.00±0.21)次〕明顯少于對照組〔(4.12±0.22)次，P=0.003〕，說明T2DM小鼠的空間參考記憶受損。

表4 兩組水迷宮定位航行實驗結(jié)果

2.4T2DM小鼠腦內(nèi)BDNF、TrkB和p75NTR mRNA表達變化 與對照組相比，T2DM組BDNF mRNA、TrkB mRNA均顯著下調(diào)(P<0.01)，而p75NTR mRNA顯著上調(diào)(P<0.01)。見表5。

2.5T2DM組大腦中proBDNF、mature BDNF、TrkB和p75NTR蛋白的變化 T2DM組proBDNF、p75NTR水平明顯高于對照組(P<0.01)，T2DM組mature BDNF、TrkB水平明顯低于對照組(P<0.01)。見表6。

表5 兩組腦BDNF、TrkB和

表6 兩組腦內(nèi)proBDNF、mature BDNF、TrkB和p75NTR蛋白濃度比較

3 討 論

高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠建立的T2DM模型，表現(xiàn)為肥胖、血糖升高和胰島素抵抗。這個模型被認為是一個非常有效的胰島素抵抗和T2DM模型〔16〕。既往研究認為，T2DM對認知的損傷在老年期更明顯〔3〕，因此本研究持續(xù)到小鼠老年期(38周齡)。本研究結(jié)果說明T2DM促進了老年小鼠的短期工作記憶和空間參考長期記憶的下降。有研究表明，肥胖、T2DM、神經(jīng)退行性疾病患者血清中BDNF水平較低〔11，17〕。T2DM患者血清BDNF 濃度與延遲記憶損傷相關(guān)〔12〕，而伴有T2DM的癡呆患者BDNF 平均水平最低〔18〕。BDNF水平降低可能在T2DM患者的認知障礙病理生理學(xué)改變中發(fā)揮重要作用〔19〕。因此，T2DM引起小鼠腦中BDNF基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)，與小鼠的短期和空間參考記憶損傷有關(guān)。

BDNF基因轉(zhuǎn)錄后，先合成proBDNF，proBDNF在細胞內(nèi)由furin蛋白酶或前蛋白轉(zhuǎn)化酶剪切形成mature BDNF。分泌到細胞外proBDNF由組織纖維蛋白溶解酶(tPA)或基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)轉(zhuǎn)化形成mature BDNF〔7，10〕。兩種BDNF有相反的生物學(xué)作用，proBDNF/mature BDNF平衡對神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)元連續(xù)更新有重要作用〔10，20〕。

和mature BDNF促進神經(jīng)元的存活、增加突觸可塑性、促進記憶〔9〕的作用相反，proBDNF是一種強大的神經(jīng)退行性疾病促進因子〔21〕。AD患者內(nèi)嗅皮層及額葉皮質(zhì)中的proBDNF水平降低，皮層區(qū)總BDNF水平與海馬區(qū)Aβ淀粉樣蛋白呈負相關(guān)，血清proBDNF與pTau染色呈正相關(guān)，TrkB水平下降，與同一區(qū)域的Aβ和pTau水平呈負相關(guān)〔22〕。proBDNF誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡，促進海馬神經(jīng)元的長時程抑制〔21〕。BDNF肽鏈上furin位點突變，引起小鼠大腦海馬區(qū)proBDNF水平升高，導(dǎo)致樹突分化減少和棘突密度降低，海馬體積變小，損害初級突觸傳遞功能，增強長時程抑制功能。向高齡老鼠海馬內(nèi)注射proBDNF后，海馬區(qū)新生神經(jīng)細胞減少，相反，給予proBDNF抗體可抵消這種不良影響〔23，24〕。

proBDNF是一個強大的神經(jīng)退行性疾病促進因子，通過激活p75NTR 和sortilin受體復(fù)合物，顯著抑制神經(jīng)干細胞增殖、減少神經(jīng)元分化、少突膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量，導(dǎo)致神經(jīng)突起塌陷、神經(jīng)元凋亡和抑制神經(jīng)發(fā)生〔21〕，損害認知功能〔7，10〕。研究表明，T2DM患者出現(xiàn)高血糖水平時，血管內(nèi)皮細胞中p75NTR水平增加〔25〕。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF參與了體重和糖代謝的調(diào)節(jié)。BDNF通過TrkB，增加能量消耗，控制體重增加，改善血糖平衡，提高胰島素敏感性〔6〕。動物研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR參與了調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和胰島素抵抗。p75NTR基因敲除小鼠，胰島素敏感性增加，能量消耗增加〔26〕。綜上，T2DM可引起老年小鼠腦內(nèi)mBDNF、proBDNF及其受體的異常調(diào)節(jié)，與T2DM相關(guān)的記憶障礙有關(guān)。有必要在今后的研究中，探索調(diào)節(jié)proBDNF和mature BDNF的生物合成過程，如改變飲食和運動，增加mature BDNF的正性作用或降低proBDNF負性作用，或阻斷p75NTR信號通路，能否同時改善T2DM合并認知障礙。