高巖 成思源 黃晶 孫路全

(天津市北辰醫(yī)院口腔科,天津 300400)

牙周炎是一種由局部因素引起的牙周支持組織慢性炎癥，是我國成年人最常見的口腔問題，也是導致成年人牙齒喪失的首位因素〔1，2〕。研究表明牙周病不僅引起口腔局部感染炎癥，而且作為細菌儲庫可引起輕微的慢性炎癥反應進而影響全身各臟器功能〔3，4〕。研究已經證實在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程中，牙周炎致病菌(如牙齦卟啉單胞菌)是通過激活炎癥細胞模式識別受體(PRRs)，包括Toll樣受體(TLRs)和NOD樣受體家族(NLRs)等，激活牙周炎癥信號通路〔5～8〕。研究已經證實牙周炎患者免疫細胞內白細胞介素(IL)-1β和IL-18的表達可因細菌的改變而表達上調，而NLRP3在其中起了關鍵性作用。Huang等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)NLRP3信號通路在慢性牙周炎炎癥早期激活過程中的重要作用。通過NLRP3信號通路，牙齦上皮細胞分泌炎癥細胞因子，如IL-1β，最終導致牙周組織破壞。NLRP3作為一種重要的代謝紊亂傳感器，控制了肥胖相關的胰島素抵抗及胰島β細胞的功能障礙。肥胖是我國公共衛(wèi)生領域一項日益嚴重的問題，由此引發(fā)的高血壓、糖尿病發(fā)生率也逐漸升高。Virto等〔10〕發(fā)現(xiàn)肥胖會導致胰島素敏感性降低，而流行病學調查發(fā)現(xiàn)，肥胖與牙周炎通過胰島素抵抗相互關聯(lián)加重肥胖及原發(fā)病。但目前，關于牙周炎、肥胖、胰島素抵抗3者之間的作用機制尚不明確。因此，本研究通過建立SD雄性大鼠牙周炎模型，旨在探討牙周炎加重肥胖大鼠胰島素抵抗的相關機制及可能的信號通路。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 40只SD雄性大鼠購于第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，動物合格證號：0001517，實驗動物使用許可證號：SYXK(渝)2017-0005。普通飼料及高脂飼料均購于浙江大學實驗動物中心。Trizol試劑、RT-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購于美國Abcam公司。飲用高溫高壓滅菌水，溫度：24～26℃；濕度：40%～70%；白晝10 h、黑夜14 h間斷照明。

1.2模型構建及分組 將40只SD大鼠隨機分為4組，根據(jù)處理方式的不同分為對照組、肥胖組、模型組、治療組。對照組：不做任何處理，浦頭飼料正常飼養(yǎng)。肥胖組：采用高脂飲食喂養(yǎng)20 w。模型組：肥胖模型構建同肥胖組，成功后通過腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定，分離上頜左側第一磨牙頰腭側牙齦，采用正畸結扎線結扎，齦溝底局部滴入牙周病炎患者的唾液10 μl/次，誘導牙周炎模型。治療組：參照模型組方法造模后，對大鼠進行牙周基礎治療，治療方法包括牙齦清潔、牙齦下刮治、1%過氧化氫(H2O2)+生理鹽水沖洗。

1.3Micro-CT檢測 處死大鼠后，取頜骨組織固定48 h。利用Micro-CT技術，在不破壞大鼠頜骨的前提下，重建內部顯微結構，測量第二磨牙釉牙骨質界(CEJ)到牙槽嵴頂(AC)的距離(CEJ-AC)，計算骨丟失量及骨剩余量。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 實驗結束后處死大鼠，取下實驗側牙槽骨，放于脫鈣液中24 h過夜，沖洗約2 h，常規(guī)石蠟包埋，牙體長軸近遠中方向切片，烤片，冷卻后低溫凍存。經二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化。蘇木素染色30～60 s，沖洗5 min，伊紅染色30 s，沖洗5 min；乙醇梯度脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，光學顯微鏡下觀察。

1.5血脂及胰島素抵抗相關指標 在處死大鼠前12 h禁食，收集大鼠眼底靜脈血進行檢測。采用比色法測定血脂指標，檢測項目包括：血清三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)。利用公式計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、β細胞功能指數(shù)(HOMA-β)、新β細胞功能指數(shù)(MBCI)。

1.6RT-PCR檢測NLRP3 mRNA、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)1 mRNA表達 處死小鼠后，解剖胰腺及肝臟組織。采用Trace試劑盒，提取mRNA，洗脫后，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA完整性。95℃預變性3 min，95℃ 30 s，退火溫度40 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，設置熒光反應在每個擴增周期后80℃ 10 s的條件下進行，最后72℃持續(xù)5 min。NLRP3上游引物：5′-TTCCATTTGTAGGCCAACGGG C-3′，下游：5′-CTGTCCGCATGTCAGCATACGT-3′;caspase1上游引物：5′-GCCACGGTGGTGAAAC AGTA-3′，下游：5′-AGCCTTGGTTCGAAACATCG-3′;β-actin上游引物：5′-GTGTTGGCGTACAGGTC TTTG-3′，下游：5′-CGTACCACTGGCATCGTG AT-3′。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組骨丟失量及剩余量比較 造模后8 w，與對照組及肥胖組比較，模型組與治療組的骨丟失量顯著升高，骨剩余量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組骨丟失量及剩余量比較

2.2牙周組織HE染色 HE染色顯示，正常組牙周組織結構完好，結合上皮附著緊密，牙槽嵴頂完整，無牙槽骨吸收。造模組牙周組織結構破壞明顯，結合上皮根向遷移，大量炎細胞浸潤，牙槽嵴頂顯著吸收，表現(xiàn)為慢性牙周炎，見圖1。

圖1 正常組和造模組牙周組織(HE染色，×400)

2.3各組血脂相關指標水平比較 模型組TG、TC、LDL-C水平顯著高于對照組，HDL-C水平顯著低于對照組(P<0.05)；治療組TG、LDL-C水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

2.4各組胰島素抵抗相關指標水平比較 與對照組和肥胖組比較，模型組HOMA-IR水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組HOMA-IR水平顯著降低(P<0.05)；4組口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)曲線下面積比較：模型組>治療組>肥胖組>對照組(P<0.05)；對照組MBCI、HOMA-β水平顯著高于其他3組，且模型組MBCI、HOMA-β水平均顯著低于肥胖組，治療組MBCI、HOMA-β水平均顯著高于模型組(P<0.05)。見表3。

表2 各組血脂相關指標水平比較

2.5各組胰腺NLRP3、caspase1 mRNA檢測 胰腺NLRP3、caspase1 mRNA水平比較：模型組>肥胖組>對照組，且治療組NLRP3、caspase1 mRNA水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表3。

2.6各組肝臟NLRP3、caspase1 mRNA檢測 模型組肝臟NLRP3、caspase1 mRNA水平顯著高于對照組和肥胖組，且治療組NLRP3、caspase1 mRNA水平顯著低于模型組(P<0.05)。見表4。

表3 各組胰島素抵抗相關指標及胰腺NLRP3、caspase1 mRNA相對表達量水平比較

表4 各組肝臟NLRP3、caspase1 mRNA相對表達量

3 討 論

胰島素抵抗貫穿2型糖尿病(T2DM)整個病程，有研究提出胰島素抵抗是T2DM誘因，與肥胖密切相關。肥胖使機體陷入慢性炎癥，最終導致外周組織發(fā)生胰島素抵抗現(xiàn)象〔11～13〕。肥胖組織有大量巨噬細胞浸潤〔14〕。脂肪相關巨噬細胞(ATMs)，尤其是CD11陽性的ATMs，產生大量促炎因子最終導致胰島素抵抗〔15〕。Deepti等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗可用于預測人群中牙齦或牙周炎癥發(fā)生風險，這可能與口腔致病細菌定植相關，這類致病菌可由口腔進入體內，進而引發(fā)心臟病、T2DM和消化道疾病。本研究結果表明模型組及治療組發(fā)生明顯的骨吸收，但在發(fā)生骨吸收的同時也存在一定的結構改建，出現(xiàn)了大量炎細胞浸潤，說明本研究構建的模型符合慢性牙周炎的慢性炎性狀態(tài)。本研究表明牙周基礎治療對緩解牙周炎大鼠的胰島素抵抗狀態(tài)有一定的效果，研究結論與柴巧學等〔17〕研究結論一致。NLRP3炎性小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和caspase1所組成〔18〕。NLRP3炎性小體能被病原體相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)激活，當NLRP3被異常激活后，可大量招募caspase1，成熟的caspase1通過剪切IL-1β與IL-18的前體形式，使其成熟并分泌到細胞外，參與機體炎性反應和天然免疫應答〔19〕。研究表明T2DM患者體內NLRP3相關信號通路的異常激活與胰島素抵抗有密切聯(lián)系〔20，21〕。本研究結果表明模型組胰腺及肝臟組織內，出現(xiàn)了NLRP信號通路相關分子的異?；罨?，但在接受牙周基礎治療后，相關信號分子的活化程度有所下降。此研究結果與研究〔20，21〕結論一致。陳一丁〔20〕研究表明老年T2DM患者外周血NLRP3炎性小體的表達水平升高，且與患者的血糖控制水平和胰島素抵抗呈正相關關系。白桂榮等〔21〕同樣也得出類似研究，其研究結論表明NLRP3在T2DM人群中表達增加，并且隨著血糖逐步增高，其胰島素抵抗也逐漸加重。