王玲 王袁 黃超 張敏 張盼盼 喻昌利

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，河北 唐山 063000；2秦皇島市第一醫(yī)院呼吸科)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是由于夜間睡眠過程中頻繁發(fā)生上呼吸道部分(低通氣)或完全(呼吸暫停)阻塞所致的一種以擾亂正常肺換氣和睡眠結(jié)構(gòu)為主的慢性呼吸障礙性疾病〔1〕。OSAHS因長期慢性間歇性缺氧可導(dǎo)致多器官多系統(tǒng)損傷，其中以腦功能受損較為顯著，主要表現(xiàn)為認知功能障礙〔2〕。依達拉奉不僅可抑制神經(jīng)元延遲死亡和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，還可保護運動神經(jīng)元免受自由基和氧化應(yīng)激損傷，以達到改善神經(jīng)功能的作用〔3〕。細胞凋亡是調(diào)節(jié)細胞死亡的主要機制，與缺氧引起的細胞死亡密切相關(guān)〔4〕。凋亡肽酶激活因子(Apaf)-1 及存活素(Survivin)是與凋亡密切相關(guān)的相關(guān)因子〔5〕。目前，關(guān)于依達拉奉對認知功能的影響已有報道，但對間歇低氧損傷后凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1、Survivin表達的影響鮮有報道。本文通過觀察依達拉奉對OSAHS 患者Apaf-1、Survivin蛋白表達水平的影響，探討依達拉奉改善認知功能障礙的可能機制。

1 材料與方法

1.1主要儀器、試劑 Apaf-1及Survivin兔抗鼠多克隆抗體、IgG羊抗兔單克隆抗體購自上海恒遠生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒及PV6001試劑盒購自三鷹生物技術(shù)有限公司；低氧箱及氮氣、氧氣購自唐山市友誼公司。

1.2實驗動物及分組 72只SPF級Wistar雄性大鼠〔體重(180±10)g〕，動物許可證號：SCXK(京)2016-0002。采用隨機數(shù)字表法分為對照組、5%間歇低氧(IH)組、依達拉奉組，每組24只，每組又分為10、21、28 d 3個時間亞組，每個時間亞組8只大鼠。

1.3動物模型的制備 制備間歇低氧大鼠動物模型。間歇低氧組大鼠低氧箱內(nèi)首先注入30 s的氮氣，流速壓力為0.15 MPa，使低氧箱內(nèi)最低氧濃度達5%，接下來注入40 s的壓縮空氣，流速壓力為0.8 MPa，使氧濃度升至21%，繼續(xù)注入50 s流速壓力不變的壓縮空氣，使氧濃度維持在21%。上述120 s為1個周期，反復(fù)進行循環(huán)。依達拉奉組大鼠于間歇低氧實驗前30 min尾靜脈注入依達拉奉(3 mg/kg)。對照組大鼠的是實驗箱持續(xù)注入壓縮空氣，流速為3 L/min，控制實驗箱內(nèi)氧濃度為21%。3組實驗大鼠每日進行實驗8 h，持續(xù)進行10、21、28 d。

1.4免疫組化檢測Apaf-1及Survivin蛋白表達 固定后的大鼠，腦組織經(jīng)二甲苯透明、切片等制備免疫組織切片。按PV兩步法操作步驟，將準備好的切片進行滴加一抗(Apaf-1兔抗大鼠抗體 1∶500稀釋、Survivin兔抗大鼠抗體1∶500稀釋)、滴加二抗等步驟，最后應(yīng)用DAB顯色試劑盒進行顯色，封片后顯微鏡下攝片。

1.5Morris水迷宮實驗 每只大鼠于實驗設(shè)計的時間點進行測試，晨起進行穿越平臺及逃避潛伏期的訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后進行上述實驗的測試，每只大鼠每天上下午各進行測試6次，記錄大鼠的逃避潛伏期時間及穿越目標象限的時間，取平均值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行獨立樣本t檢驗和重復(fù)測量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化檢測Apaf-1及Survivin蛋白表達 光學(xué)顯微鏡下顯示，對照組各個時間點Apaf-1及Survivin蛋白表達較少；與對照組比較，5%IH組及依達拉奉組各個時間點Apaf-1、Survivin蛋白的表達明顯增多(P<0.05)；與5%IH組比較，依達拉奉組各個時間點Apaf-1蛋白表達均明顯減少，Survivin蛋白表達均明顯增加(均P<0.05)，見表1，圖1，圖2。

表1 3組不同時間點Apaf-1表達比較

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察兩組Apaf-1蛋白表達(免疫組化，×400)

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察兩組Survivin蛋白表達(免疫組化，×400)

2.2Morris水迷宮實驗

2.2.1定位航行實驗 對照組各個時間點逃避潛伏期無明顯差異(均P>0.05)；與對照組比較，5%IH組及依達拉奉組各時間點逃避潛伏期明顯延長(均P<0.05)；與5%IH組比較，依達拉奉組各時間點逃避潛伏期明顯縮短(均P<0.05)，見表2。

2.2.2空間探索實驗 對照組各個時間點跨越目標象限時間無明顯差異(均P>0.05)；與對照組比較，5%IH組及依達拉奉組各時間點目標象限跨越時間明顯縮短(均P<0.05)；與5%IH組比較，依達拉奉組各時間點目標象限跨越時間明顯延長(均P<0.05)，見表2。

表2 3組不同時間點逃避潛伏期及跨越目標象限時間比較

3 討 論

隨著人們生活水平的提高，肥胖、糖尿病等疾病高發(fā)，OSAHS患病率呈升高趨勢，是呼吸系統(tǒng)常見病。OSAHS可引起神經(jīng)系統(tǒng)損害，如認知功能下降，嚴重影響人們的生活及工作〔6〕。依達拉奉作為神經(jīng)內(nèi)科重要的腦保護藥物，臨床已廣泛應(yīng)用。研究證實，依達拉奉可通過抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷進而改善認知功能〔7〕。本研究結(jié)果說明，間歇低氧損傷造成了大鼠認知功能下降，應(yīng)用依達拉奉干預(yù)后，認知功能得到改善。

Apaf-1在凋亡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，Apaf-1與細胞色素c和dATP結(jié)合后組成一個低聚凋亡小體，負責自動催化活化pro-caspase-9(Apaf-3)，進而激活caspase-3和細胞凋亡〔8〕。Survivin屬于凋亡抑制因子(IAPs)基因家族中分子量最小但抑制凋亡能力最強的一員，其被BIRC5基因編碼，可參與控制有絲分裂、調(diào)節(jié)細胞凋亡和細胞應(yīng)激反應(yīng)3個細胞過程〔9〕。研究報道，缺氧性腦損傷通過誘導(dǎo)大鼠腦組織Apaf-1表達，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加〔10〕。有研究也證實了間歇低氧可引起Survivin表達的增加，可能抑制了神經(jīng)元的凋亡〔11〕。本實驗結(jié)果提示，間歇低氧促進了Apaf-1、Survivin蛋白的表達，加用依達拉奉干預(yù)后，使促凋亡因子Apaf-1的表達下降，抑制凋亡因子Survivin蛋白的表達增加，進而改善了認知功能。這與既往研究證實依達拉奉通過減少腦損傷后神經(jīng)細胞的凋亡進而發(fā)揮腦保護作用一致〔12〕。

綜上，依達拉奉可通過調(diào)節(jié)凋亡因子Apaf-1、Survivin蛋白表達的水平，進而改善間歇低氧損傷后大鼠的認知功能。