柯維春 蘇慶杰 陳向紅 王超

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海南 ?？?570000)

缺血性腦卒中(CIS)又稱腦梗死，是指腦血液循環(huán)障礙導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損綜合征，發(fā)病率和致死致殘率極高，嚴(yán)重威脅人類的生命健康〔1，2〕。賈琎等〔3〕認(rèn)為CIS相關(guān)發(fā)病機(jī)制與生化機(jī)制、血流動力學(xué)改變及病理生理學(xué)機(jī)制有關(guān)，血糖、血壓、頸動脈粥樣硬化及炎癥反應(yīng)等均是CIS發(fā)病的高危因素。在分子作用機(jī)制中，有研究證實(shí)急性CIS的發(fā)生發(fā)展與miRNA關(guān)系密切〔2〕。盡管如此，CIS相關(guān)機(jī)制仍未完全闡明，因此開展相關(guān)研究以進(jìn)一步了解其機(jī)制具有重要的意義。鋅指E盒結(jié)合同源框(ZEB)1是鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，存在與肌肉、神經(jīng)系統(tǒng)和淋巴細(xì)胞等系統(tǒng)中，李道靜〔4〕認(rèn)為ZEB1蛋白表達(dá)可影響急性CIS后的炎癥損傷機(jī)制。 本研究旨在觀察CIS模型大鼠炎癥反應(yīng)及大腦皮層組織miR-181a和ZEB1蛋白水平變化情況，利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析miR-181a對小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用，初步探討miR-181a調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞ZEB1影響CIS模型炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動物：小膠質(zhì)細(xì)胞(BV2)購自北京協(xié)和醫(yī)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心。清潔級健康SD大鼠36只，6～8周齡，雌雄各半，體重(285±10)g，SD大鼠購自實(shí)驗(yàn)中心。本實(shí)驗(yàn)研究通過了動物倫理。符合道德倫理要求。

實(shí)驗(yàn)試劑：12%水合氯醛購自青島青爾源藥業(yè)有限公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)和原位末端標(biāo)記染色(TUNEL)試劑盒(購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，Trizol 試劑(購自上海Invitrogen公司)，PCR試劑盒(購自Promega公司)，miR-181a拮抗劑(miR-181a inhibitor)、激動劑(hsa-miR-181a)及空白對照(miRNA Neg-tive Control)由上海達(dá)科為生物技術(shù)公司合成，RIPA裂解液(購自上海碧云天公司)。ZEB1一抗(批號：sc-263052，購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司)，NF-κB一抗(批號：XY-ABS194，購自上海熹垣生物科技有限公司)，GAPDH一抗(批號：532941，購自北京中杉金橋公司)。

實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)時熒光定量PCR儀屬Applied Biosystems產(chǎn)品，高速離心機(jī)屬德國Eppendorf公司產(chǎn)品，電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)屬美國Bio-Rad公司產(chǎn)品 。

1.2CIS模型建立及分組 將SD大鼠進(jìn)行雌雄分類后，從雌、雄兩個整體中各隨機(jī)選取8只大鼠分別分為對照組、假傷組和模型組，每組16只。模型組大鼠根據(jù)文獻(xiàn)方法〔5〕建立CIS模型，具體步驟如下：用12%水合氯醛對大鼠進(jìn)行麻醉后，在無菌操作臺上用手術(shù)剪剪開大鼠頸部皮膚，充分暴露頸部血管，小心分離大鼠右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，使拴線從大鼠頸外動脈殘端插入頸內(nèi)動脈，直至距頸外動脈與頸內(nèi)動脈分叉處1.8 cm處停止。線栓停留1.5 h后拔除栓子，制備CIS模型，拔除栓子后，將大鼠尾部提起，可見大鼠左側(cè)前肢屈曲則視為造模成功。假傷組大鼠以相同的步驟分離大鼠右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，但不插入栓線，對照組大鼠未進(jìn)行任何干預(yù)。

1.3大鼠血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CPR)、白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)水平檢測 抽取大鼠尾靜脈血3 ml，在室溫條件下以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離出大鼠血清用于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測。采用免疫比濁法檢測血清CRP表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。

1.4RT-PCR檢測大鼠大腦皮層組織miR-181a和ZEB1 mRNA的表達(dá)量 利用頸椎脫臼法處死各組大鼠，取大鼠大腦皮層組織約1 g置入研磨器中，加入液氮粉碎研磨，再加入組織裂解液裂解組織，采用Trizol法提取組織總RNA，檢測提取RNA的濃度和純度后，按照PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR引物：miR-181a上游：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′、下游：5′-TTCGCACT GGATACGACACTCACC-3′；ZEB1上游：5′-GCACAA CCAAGTGCAGAAGA-3′、下游：5′-CATTTGCAGATTGAGCTGA-3′；GAPDH上游：5′-GAAGGTGAAGGTC GGAGT-3′、下游：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。設(shè)置好qRT-PCR體系，設(shè)置反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt公式計(jì)算miR-181a和ZEB1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.5Western印跡檢測大鼠大腦皮層組織ZEB1蛋白表達(dá)量 利用頸椎脫臼法處死各組大鼠，取大鼠大腦皮層組織約1 g置入研磨器中，加入液氮粉碎研磨，再加入組織裂解液裂解組織，提取大腦皮層組織總蛋白，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進(jìn)行定量，按比例加入4×蛋白上樣緩沖液，95℃變性5 min，置于-20℃保存?zhèn)溆?。設(shè)置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)印。取聚偏氟乙烯(PVDF)膜用TBST洗膜5 min，共3次，加入到2%牛血清蛋白(BSA)Tris-HCL緩沖鹽溶液(BSATBS)配制封閉液中進(jìn)行封閉，室溫?fù)u床孵育2 h。洗膜后先后加入一抗工作液(ZEB1抗體)和二抗工作液，進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育。將新鮮配制的電化學(xué)發(fā)光(ECL)液滴加到PVDF膜表面，轉(zhuǎn)移至成像分析系統(tǒng)暗箱中曝光，采集圖像并分析。蛋白定量：以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行分析，以相對光密度值代表蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次均值。

1.6BV2培養(yǎng) 取BV2進(jìn)行復(fù)蘇，將復(fù)蘇后的細(xì)胞置于含10%胎牛血清培養(yǎng)基中，放入條件為5%CO2、37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁時，每隔2～3 d傳代1次，觀察細(xì)胞貼壁生長且狀態(tài)良好后，按1×106/ml接種于6孔板中。

1.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取100 μl 1×106/ml的上述細(xì)胞接種于96孔板中，分別轉(zhuǎn)染miRNA Negtive Control、miR-181a inhibitor和激動劑hsa-miR-181a，分為空白對照組、抑制表達(dá)組和促進(jìn)表達(dá)組，每組設(shè)立8個復(fù)孔，觀察相關(guān)指標(biāo)的變化。

1.8轉(zhuǎn)染細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)檢測 收集96孔板中的各組細(xì)胞，利用RT-PCR(方法同1.2.3)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-181a和ZEB1 mRNA的表達(dá)量，Western印跡(方法同1.5)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞ZEB1蛋白表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)，兩兩比較用Nemenyi檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血清炎癥因子hs-CPR、IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較 3組血清炎癥因子hs-CPR、IL-6和TNF-α表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與對照組比較，假傷組和模型組hs-CPR、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均明顯升高(均P<0.05)，且模型組均明顯高于假傷組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組血清炎癥因子hs-CPR、IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較

2.2各組大腦皮層組織miR-181a、ZEB1蛋白及ZEB1 mRNA相對表達(dá)量比較 3組腦組織miR-181a、ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。與對照組和假傷組比較，模型組miR-181a、ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量均明顯升高(均P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 Western印跡檢測ZEB1蛋白表達(dá)

表2 各組大腦皮層組織miR-181a、ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較

2.3模型組大腦皮層組織miR-181a、ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量與炎癥因子相關(guān)性 血清hs-CPR、IL-6和TNF-α表達(dá)與miR-181a相對表達(dá)量呈正相關(guān)(均P<0.001)，與ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見表3。

表3 模型組大鼠皮層組織miR-181a、ZEB1蛋白及mRNA表達(dá)與炎癥因子相關(guān)性

2.4各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-181a相對表達(dá)量 3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-181a相對表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對照組(1.04±0.07)比較，抑制表達(dá)組miR-181a相對表達(dá)量明顯下降(0.59±0.05，P<0.05)，促進(jìn)表達(dá)組miR-181a相對表達(dá)量明顯升高(2.40±0.13,P<0.05)。

2.5各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較 3組轉(zhuǎn)染細(xì)胞ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與空白對照組比較，抑制表達(dá)組ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，促進(jìn)表達(dá)組ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 Western印跡檢測ZEB1蛋白表達(dá)

表4 各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞ZEB1蛋白及mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

CIS相關(guān)機(jī)制研究中，需要獲取大腦皮層組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，而腦部是人重要中樞系統(tǒng)，并不能在人體上進(jìn)行取材。因此，在符合倫理學(xué)的要求下可用動物模型代替，盡管人與動物基因稍有差異，但在保證動物模型發(fā)病機(jī)制與人CIS發(fā)病機(jī)制相同的情況下，動物模型用于實(shí)驗(yàn)研究具有重要的意義。動物模型是以適用于人體為最終目的，動物的選擇及模型建立成功與否直接關(guān)乎實(shí)驗(yàn)成敗，目前關(guān)于CIS模型建立的報(bào)道較多，研究顯示豬、鼠、兔均可用于CIS模型建立〔6～8〕。本實(shí)驗(yàn)研究考慮大鼠容易飼養(yǎng)、體型適中便于手術(shù)操作及大腦皮層組織取材量較少等因素，而且采用Zea Longa線栓法制作大鼠CIS模型具有成功的先例〔5〕，因此使用SD大鼠建立模型是可行的。模型組大鼠在拔除栓子后，提起其尾部可見左側(cè)前肢屈曲，提示造模成功，為接下來實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

炎癥是公認(rèn)的CIS發(fā)病原因，研究顯示機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時大量表達(dá)各種炎性細(xì)胞因子，可加重大腦皮層組織的缺血損傷〔9〕。IL-6、TNF-α及hs-CRP作為重要的炎癥指標(biāo)，CIS患者的血清IL-6、TNF-α及hs-CRP水平在一定程度上可反映大腦皮層組織的損傷程度〔10～12〕。本研究結(jié)果結(jié)果提示假傷組和模型組大鼠機(jī)體內(nèi)均發(fā)生炎癥反應(yīng)，模型組表達(dá)水平更高是由于缺血后發(fā)生腦卒中造成的。微小RNA(miRNA)可以特異性結(jié)合靶基因mRNAs的非編碼區(qū)，發(fā)揮促進(jìn)或抑制靶蛋白翻譯的功能，調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因而影響到生物學(xué)功能〔13〕，miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)豐富，并且在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能上起到重要作用。研究顯示miR-377基因敲除可減輕缺血性再灌注的腦損傷〔14〕，miR-940通過VEGF調(diào)節(jié)腦梗死后血管生成影響CIS模型的腦損傷〔15〕。miR-181由4種高度保守的成熟miRNA構(gòu)成，主要位于3條不同的染色體上，能夠啟動G0/G1期，從而促進(jìn)細(xì)胞的分裂和增殖〔16〕。本研究結(jié)果提示大鼠發(fā)生CIS后其大腦皮層組織miR-181a表達(dá)升高，miR-181a與CIS發(fā)生相關(guān)，這與miR-181a誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷有關(guān)〔17〕。ZEB1在人腦膠質(zhì)中高度表達(dá)，研究顯示在突變的低級別膠質(zhì)瘤中ZEB1表達(dá)增加〔18〕，細(xì)胞異質(zhì)性與人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中ZEB1亞型特異性表達(dá)有關(guān)〔19〕。另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞ZEB1上調(diào)可減輕急性CIS后的腦損傷〔20〕。本研究結(jié)果與李道靜〔4〕結(jié)果相似，提示CIS發(fā)生可促使大腦皮層組織大量分泌ZEB1。結(jié)果表明miR-181a降低和ZEB1升高對抑制炎癥反應(yīng)作用具有積極作用。

大腦皮質(zhì)層中富含小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后有兩種極化表型，即經(jīng)典激活型小膠質(zhì)細(xì)胞(M1型)和替代激活型小膠質(zhì)細(xì)胞(M2型)，分別起著促炎與抑炎的作用〔21〕。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的第一道防線，在激活炎癥反應(yīng)中起主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果表明抑制miR-181a可上調(diào)ZEB1的表達(dá)。