李超 楊偉偉 王梅 王雪 劉翠翠 陳俊榮

(1滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥理教研室，河北 滄州 061001；2滄州市中心醫(yī)院婦二科)

在人體的生長發(fā)育過程中，碘是不可或缺的，有研究表明，體內(nèi)碘缺乏會導(dǎo)致多種疾病，并引起能量代謝功能障礙及其氧化系統(tǒng)損傷等〔1〕。黃芪是常見的補氣中草藥，有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)機(jī)體代謝和延緩衰老等作用〔2〕，通過對中藥黃芪進(jìn)行發(fā)酵制備可使其有效利用〔3〕。本實驗探討黃芪及其發(fā)酵物對碘缺乏誘導(dǎo)的大鼠抗氧化系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用和相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 80只SPF級Wistar大鼠，4周齡，雌雄各半，體重100～120 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，大鼠許可證號：SCXK(京)2016-0002，使用許可證號：SYXK(冀)2019-006。12 h晝夜循環(huán)，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度(60±5)%。動物的使用及操作按照滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實驗動物管理委員會(IACUC2019046)的規(guī)定執(zhí)行。動物實驗過程中遵守3R原則。

1.2儀器和試藥 超速冷凍離心機(jī)(Sigma 3K15)購自德國Sigma公司；酶標(biāo)儀(Spectra MaxM4)購自美國分子公司；微型混勻器(H-1)購自上?？岛凸怆妰x器有限公司；水浴恒溫振蕩器(SHA-B)購自常州國華電器有限公司；Morris水迷宮購自上海欣軟信息科技有限公司。血清皮質(zhì)醇(CoRT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司(貨號：YS03606B)；總抗氧化能力(T-AOC，貨號：A015-2-1)、單胺氧化酶(MAO，貨號：A034-1-1)、乳酸(LD，貨號：A019-2-1)、乳酸脫氫酶(LDH，貨號：A020-2-2)、ATP酶(ATPase)檢測試劑盒(貨號：A070-2-2、A070-5-1、A070-4-2)均購自南京建成生物工程研究所。碘缺乏飼料(碘含量20 μg/kg)由北京小黍有泰生物科技有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0007。

1.3實驗藥品的制備 黃芪提取液〔4〕和黃芪發(fā)酵提取液〔5〕(滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實驗室自制)分別將生藥稀釋成4、2、1 g/kg備用。

1.4方法

1.4.1實驗分組 取SPF級Wistar大鼠4周齡80只，體重100～120 g，按體重分為8組：正常組，模型組，高、中、低劑量黃芪組(4、2、1 g/kg)及高、中、低劑量發(fā)酵物組(4、2、1 g/kg)，每組雌雄各半分籠飼養(yǎng)。正常組全程飼以普通飼料，每日等體積雙蒸水。其余組大鼠飼以低碘飼料，每日等體積雙蒸水。3個月后復(fù)制出碘缺乏致甲狀腺腫模型〔6〕。造模后，除正常組和模型組外各組大鼠均按10 ml/kg予以相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)給藥4 w，正常組、模型組給予等體積雙蒸水。實驗期間繼續(xù)給藥。

1.4.2Morris水迷宮實驗 造模后31 d進(jìn)行Morris水迷宮實驗。水池直徑為160 cm，池壁分為NW、SW、SE、EN 4個象限，水溫控制在(22±1)℃，在SW象限中心的水面下2 cm處放置1個透明平臺。①適應(yīng)階段：在正式實驗前1 d將大鼠放置水池中任意游60 s，讓其自由適應(yīng)環(huán)境；②定位航行實驗：該階段共進(jìn)行4 d，每天4次，每次將大鼠從不同象限的中點位置面朝池壁放入水中，記錄每次從入水點到找到水下平臺的時間(即逃避潛伏期)〔7〕。實驗記錄總時長為90 s，若大鼠在90 s內(nèi)未能找到平臺，則手動引導(dǎo)其到達(dá)平臺30 s，此次的逃避潛伏期計為90 s。

1.4.3樣本采集及其臟器系數(shù)的測定 Morris水迷宮實驗結(jié)束后禁食24 h，股靜脈取血分離血清，同時迅速取出腦組織，冰盒上快速小心剝離出大鼠的腦組織，去除表面結(jié)締組織，濾紙擦干，分別稱重并計算腦系數(shù)(腦系數(shù)=腦重量/體重×100%)。血清及腦組織置于-80℃冰箱保存待測。

1.4.4大鼠血清T-AOC活力和MAO、CoRT含量測定 取適量血清依據(jù)試劑盒說明分別測定大鼠血清中T-AOC活力和MAO的含量，ELISA檢測CoRT含量。

1.4.5大鼠腦組織LD含量及LDH、ATP酶活力測定 取適量腦組織，分別以1∶9(M∶V)加入4℃生理鹽水進(jìn)行組織勻漿，采用相關(guān)試劑盒測定總蛋白、LD含量及LDH、ATP酶活力。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組Morris水迷宮實驗逃避潛伏期比較 與正常組比較，實驗第2天開始模型組逃避潛伏期均顯著延長(均P<0.05)；與模型組比較，實驗第2天開始高劑量黃芪組及高劑量發(fā)酵物組逃避潛伏期均顯著縮短(均P<0.05)。見表1。

表1 各組Morris水迷宮實驗逃避潛伏期比較

2.2各組體重、腦系數(shù)比較 與正常組比較，模型組體重及腦系數(shù)均顯著降低(均P<0.05)；與模型組比較，高、中劑量黃芪組及高、中劑量發(fā)酵物組體重均顯著增加，高劑量黃芪組及高劑量發(fā)酵物組腦系數(shù)均顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組體重及腦系數(shù)比較

2.3各組血清T-AOC活力及MAO、CoRT含量比較 與正常組比較，模型組T-AOC活力顯著降低，MAO、CoRT水平均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，高劑量黃芪組及高劑量發(fā)酵物組T-AOC活力顯著升高，高、中劑量黃芪組及高、中劑量發(fā)酵物組MAO、CoRT水平均顯著降低(均P<0.05)。見表3。

2.4各組腦組織中LD、LDH及ATP酶水平比較 與正常組比較，模型組LD水平顯著升高，LDH、鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶、鈣ATP酶水平均顯著降低(均P<0.05)；與模型組比較，高劑量黃芪組及高劑量發(fā)酵物組LD水平顯著降低，LDH、鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶、鈣ATP酶水平均顯著升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組血清T-AOC活力、MAO、CoRT含量、腦組織LD、LDH及ATP酶水平比較

3 討 論

學(xué)習(xí)記憶障礙是碘缺乏所致甲狀腺功能減退癥患者普遍的臨床表現(xiàn)〔8〕。學(xué)習(xí)記憶功能還與中樞神經(jīng)遞質(zhì)代謝密切相關(guān)〔9〕，其中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在學(xué)習(xí)記憶過程中不可忽視。有研究表明單胺類神經(jīng)遞質(zhì)可參與神經(jīng)內(nèi)分泌或內(nèi)分泌免疫網(wǎng)的調(diào)節(jié)，從而影響機(jī)體的精神行為、學(xué)習(xí)、記憶等功能〔10，11〕。MAO廣泛存在于不同器官、組織中，它是分解體內(nèi)單胺類物質(zhì)的重要酶系〔12〕。

正常條件下，甲狀腺激素的合成與代謝都伴隨自由基產(chǎn)生，而甲狀腺對氧化應(yīng)激引起的損傷有完善的保護(hù)系統(tǒng)，維持機(jī)體正常的氧化平衡〔13〕。碘與甲狀腺氧化損傷密切相關(guān)〔14〕。缺碘可引起甲狀腺氧化損傷，導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸發(fā)生功能變化，引起垂體、腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)，分泌大量CoRT，導(dǎo)致并發(fā)癥，這可能是碘缺乏導(dǎo)致甲狀腺疾病的機(jī)制之一〔15〕。在氧化應(yīng)激等條件刺激下，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性變，當(dāng)機(jī)體處于亞健康或疾病狀態(tài)時，血清T-AOC可作為疾病的診斷和預(yù)測指標(biāo)〔16，17〕。碘缺乏可造成血清T-AOC活力顯著降低和應(yīng)激代謝產(chǎn)物CoRT含量顯著增加。

碘對促進(jìn)人體生長發(fā)育與維持能量代謝有非常重要的作用，碘缺乏影響大鼠的攝食、飲水、排泄等生理活動，引起能量利用障礙〔18，19〕。乳酸是糖酵解終產(chǎn)物，LD增加，LDH活力降低，引起腦膠質(zhì)細(xì)胞損害，出現(xiàn)功能障礙〔20〕；鈉鉀ATP酶、鈣鎂ATP酶和微量鈣ATP酶是鈣離子分布的基礎(chǔ)，當(dāng)這些ATP酶活性降低時，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度急劇增高，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及其骨架不穩(wěn)定，使通透性增加，造成ATP大量耗竭，腦細(xì)胞能量代謝嚴(yán)重受損〔21，22〕。

綜上，黃芪發(fā)酵物能改善碘缺乏誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激系統(tǒng)損傷，其保護(hù)機(jī)制主要是通過抑制單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，改善能量代謝障礙，提高抗氧化系統(tǒng)的防御能力而發(fā)揮其治療作用來實現(xiàn)。