李莉英 方立 苑聰 張銀妝 鄒斌 熊巍

(長沙市第一醫(yī)院心內(nèi)二科，湖南 長沙 410005)

急性心肌梗死(AMI)是一種嚴(yán)重的心臟疾病，手術(shù)治療是主要的治療方式，能夠重新建立血供，但對損傷的心肌細(xì)胞無修復(fù)作用〔1,2〕。有研究表明〔3〕，內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)促進(jìn)了AMI后的心肌纖維化，而提高AMI后的自噬水平，可抑制EndMT，減輕心肌纖維化，改善心功能。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是一種骨髓的干細(xì)胞亞群，其與血管新生密切相關(guān)。有研究表明，EPCs在重建血供、促進(jìn)血管新生和緩解內(nèi)皮細(xì)胞障礙中發(fā)揮著重要作用〔4〕。在AMI治療中，其能有效促進(jìn)血管重建，改善心功能，本研究探討自體EPCs移植對AMI的干預(yù)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 研究動物：選取SPF級40只SD健康大鼠，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，鼠齡(3.9±0.3)個月，體重(227.7±10.8)g。所有大鼠養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間1 w。本實驗均獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑：內(nèi)皮素(ET)-1、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)、一氧化氮(NO)試劑盒(上海科敏生物科技有限公司)、人三型前膠原肽(PⅢP)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)兔抗大鼠肝細(xì)胞生長因子(HGF)抗體(上海振譽(yù)生物科技有限公司)、大鼠抗小鼠HGF受體原癌基因(c-Met)抗體(北京義翹神州科技有限公司)。

EPCs細(xì)胞分離和培養(yǎng)：在無菌條件下，取3 ml的心臟血液，使用磷酸二氫鹽緩沖液進(jìn)行1倍稀釋，置于淋巴細(xì)胞分離液之上，采用離心法對單個核細(xì)胞進(jìn)行收集，進(jìn)行洗滌2次，按照5×106個/孔與纖維連接蛋白包被的24孔培養(yǎng)板中，然后再加入20%的胎牛血清、30 μg/ml的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、100 U/ml青霉素及100 U/ml的鏈霉素的M199培養(yǎng)液，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后換液，除去未貼壁細(xì)胞，每3～4 d換液1次。

1.2方法

1.2.1分組、建模及給藥 隨機(jī)選取40只大鼠中10只為正常組，剩余30只大鼠均參照靳文學(xué)等〔5〕建立AMI大鼠模型，將大鼠進(jìn)行麻醉，進(jìn)行氣管插管觀察各大鼠心電圖變化，對所有大鼠進(jìn)行開胸，對左冠狀動脈前降支近段進(jìn)行結(jié)扎，當(dāng)其顏色變暗，心臟變大，心肌運動明顯減弱及心電圖ST段抬高則表示模型建立成功，模型建立成功后，將30只大鼠隨機(jī)分為模型組10只、陽性對照組10只、EPCs移植組10只。模型組不進(jìn)行任何藥物治療，陽性對照組使用阿托伐他汀鈣進(jìn)行治療，劑量20 mg/kg，與3 ml的生理鹽水混合進(jìn)行灌胃處理；EPCs移植組使用50 μl EPCs在心肌梗死區(qū)進(jìn)行注射。

1.2.2樣本采集 所有大鼠在給藥8 w后，靜脈采血后處死，以離心半徑為5 cm、以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80℃保存，待用。

1.2.3切片及染色 取心肌組織，在4%多聚甲醛進(jìn)行固定、脫水透明，浸蠟包埋，脫蠟、蘇木素-伊紅(HE)染色，之后脫水、透明，切片厚度為4 μm，待封片晾干后顯微鏡下觀察大鼠心肌組織病理表現(xiàn)。

1.2.4檢測心功能指標(biāo)水平 使用美國GE公司vivid7型彩色多普勒超聲心動圖儀檢測室間隔厚度(IVSD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期容積(LVESV)、短軸縮短率(FS)、射血分?jǐn)?shù)(EF)。

1.2.5檢測ET-1、NO、PⅢP水平 采用酶聯(lián)免疫吸附對ET-1、NO、PⅢP水平。

1.2.6檢測LDH、ALT、AST水平 使用酶標(biāo)儀對LDH、ALT、AST水平進(jìn)行檢測。

1.2.7HGF/c-Met通路蛋白檢測 Western印跡檢測HGF、c-Met通路蛋白，提取大鼠肺組織中樣品總蛋白，將其與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min后，進(jìn)行電泳，并將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%脫脂奶粉封閉1～2 h，然后加入一抗溶液TBST(HGF、c-Met按照1∶1 000稀釋)，在4℃條件下進(jìn)行震蕩過夜，再次洗滌，放入二抗溶液TBST(HGF、c-Met按照1∶5 000稀釋)，室內(nèi)震蕩120 min后，洗滌，顯色成像，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)觀察 正常組心肌排列整齊，細(xì)胞核明顯，染色均勻，未見肌纖維肥大、斷裂；模型組心肌纖維損傷，排列不整齊，斷裂明顯，并可見較多壞死灶；陽性對照組明顯改善心肌損傷，EPCs移植組改善心肌損傷最為明顯。見圖1。

圖1 4組心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化(HE，×200)

2.2各組IVSD、LVESD、LVESV、LVEDD、FS、EF比較 EPCs移植組、陽性對照組、模型組IVSD、FS、EF顯著低于正常組，LVESD、LVESV、LVEDD顯著高于正常組(P<0.05)；EPCs移植組、陽性對照組IVSD、FS、EF顯著高于模型組，LVESD、LVESV、LVEDD顯著低于模型組(P<0.05)；EPCs移植組IVSD、FS、EF顯著高于陽性對照組，LVESD、LVESV、LVEDD顯著低于陽性對照組(P<0.05)。見表1。

2.3各組ET-1、NO、PⅢP水平比較 EPCs移植組、陽性對照組、模型組ET-1、PⅢP水平顯著高于正常組，NO水平顯著低于正常組(P<0.05)；EPCs移植組、陽性對照組ET-1、PⅢP水平顯著低于模型組，NO水平顯著高于模型組(P<0.05)；EPCs移植組ET-1、PⅢP水平顯著低于陽性對照組，NO水平顯著高于陽性對照組(P<0.05)。見表2。

2.4各組LDH、ALT、AST水平比較 EPCs移植組、陽性對照組、模型組LDH、ALT、AST水平顯著高于正常組(P<0.05)；EPCs移植組、陽性對照組LDH、ALT、AST水平顯著低于模型組(P<0.05)；EPCs移植組LDH、ALT、AST水平顯著低于陽性對照組(P<0.05)。見表2。

表1 各組IVSD、LVESD、LVESV、LVEDD、FS、EF比較

表2 各組ET-1、NO、PⅢP、LDH、ALT、AST水平比較

2.5各組HGF/c-Met通路蛋白表達(dá)量比較 EPCs移植組、陽性對照組、模型組HGF、c-Met蛋白表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；EPCs移植組、陽性對照組HGF、c-Met蛋白表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)；EPCs移植組HGF、c-Met蛋白表達(dá)量顯著低于陽性對照組(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組HGF/c-Met通路蛋白表達(dá)量比較

圖2 Western印跡檢測心肌組織中HGF/c-Met通路蛋白HGF、c-Met蛋白

3 討 論

AMI是冠狀動脈發(fā)生急性和持續(xù)性的一種缺血缺氧性心肌壞死。有研究表明，再灌注會增加心肌供血和供氧，但其會造成心肌的再次損傷〔6,7〕。唐一峰等〔8〕研究表明，通過使用高遷移率族蛋白(HMG)B1注射聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植的治療方法可有效改善AMI預(yù)后。

EPCs主要源于骨髓和外周血中，有細(xì)胞分化功能，被廣泛應(yīng)用于心肌成形術(shù)中〔9,10〕。劉革銘等〔11〕研究表明，外周血EPCs移植可顯著改善AMI大鼠心功能，EPCs移植同時予以丹參注射液優(yōu)于單獨應(yīng)用EPCs移植，起到心肌修復(fù)的協(xié)同作用。EPCs細(xì)胞移植后，因環(huán)境較差，并不能長期生存，因此為其提供較好的生存環(huán)境已成為研究進(jìn)一步突破的重點。黃磊等〔12〕研究表明，緩激肽預(yù)處理能明顯促進(jìn)EPCs增殖,降低細(xì)胞凋亡,緩激肽預(yù)適應(yīng)EPCs移植能明顯減少小鼠心肌梗死面積并促進(jìn)心肌血管的新生，使心功能得到改善。本研究結(jié)果說明，EPCs移植能有效改善各組心功能水平，效果顯著。

ET-1由內(nèi)皮細(xì)胞釋放，可收縮血管。PⅢP主要在心肌細(xì)胞中表達(dá)，被認(rèn)為是能反映心肌纖維化的重要指標(biāo)，而NO是由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的輸血管物質(zhì)，能保護(hù)血管內(nèi)皮。李景瑞等〔13〕研究表明，經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)術(shù)前應(yīng)用替羅非班可緩解臨床癥狀，改善心功能，保護(hù)血管內(nèi)皮，恢復(fù)冠狀動脈血流灌注，但應(yīng)注意其出血風(fēng)險。張輝等〔14〕研究表明，瑞舒伐他汀可有效改善AMI患者PCI術(shù)后的血管內(nèi)皮功能及炎性因子水平，提高療效，從而改善患者的生活質(zhì)量。本研究結(jié)果說明EPCs移植能有效降低各組ET-1、PⅢP水平，提高NO水平，效果顯著。楊偉峰等〔15〕也認(rèn)同此結(jié)果。

LDH、ALT、AST水平的測定能有效反映出AMI程度和對AMI的判定。當(dāng)LDH、ALT、AST水平明顯升高時，則表示心肌細(xì)胞處于變性壞死期，細(xì)胞明顯受損〔16〕。本研究結(jié)果說明，EPCs移植能有效降低LDH、ALT、AST水平，減輕心肌細(xì)胞受損程度，效果顯著。王建飛等〔17〕研究表明，H-FABP更利于AMI的超早期診斷，便于臨床醫(yī)生給患者提供更高效的治療方案。佘靈芝等〔18〕研究表明，檢測心肌組織S100A1、LDH和肌酸激酶同工酶(CK-MB)表達(dá)有助于AMI的判斷。均與本研究結(jié)果一致。

HGF是間質(zhì)細(xì)胞衍生的一種能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂且具有多功能的因子，是由α鏈和β鏈組成的異二聚體，其受體為原癌基因c-Met，能夠誘導(dǎo)c-Met受體酪氨酸磷酸化。HGF能改善高血壓和相關(guān)動脈硬化及心力衰竭。HGF通路在心血管疾病中也發(fā)揮著重要作用。相關(guān)研究表明AMI患者體內(nèi)HGF水平會大幅度上升，且與心肌重構(gòu)有相關(guān)性〔19〕。本研究結(jié)果表明，EPCs移植能有效降低HGF、C-Met表達(dá)，效果顯著。袁博等〔20〕也認(rèn)同此結(jié)果。