張馳昊 高冬梅 鄭迪 軒永麗 李文華,

(徐州醫(yī)科大學(xué) 1心血管病研究所，江蘇 徐州 221000；2附屬醫(yī)院)

隨著冠心病的診斷、介入和放射診療技術(shù)的發(fā)展，對(duì)比劑的廣泛使用，由對(duì)比劑引起的急性腎損傷(CI-AKI)逐漸成為醫(yī)源性腎衰竭的常見(jiàn)原因之一〔1〕。同時(shí)，CI-AKI、支架內(nèi)血栓和支架內(nèi)再狹窄已成為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)患者術(shù)后的三大并發(fā)癥〔2〕，也是PCI術(shù)后1年死亡、心肌梗死和靶血管重建風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素〔3〕。CI-AKI的發(fā)生增加患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，病情嚴(yán)重者可發(fā)展為慢性腎功能衰竭，甚至需要腎臟替代治療，嚴(yán)重威脅患者預(yù)后。

CI-AKI的發(fā)病機(jī)制未完全明確，多種因素可能參與了CI-AKI的發(fā)生發(fā)展。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，對(duì)比劑引起氧自由基損傷〔4〕、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變〔5〕及對(duì)比劑的直接腎小管毒性損傷〔6〕是其重要機(jī)制。此外，還可能與腎小管阻塞、內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量減少、炎癥反應(yīng)和免疫機(jī)制相關(guān)。本研究旨在探討蝦青素(AST)在碘海醇(CM)誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料 人近端腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2)；AST(sigma)；CM(揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司)；胎牛血清(四季青，中國(guó))；DMEM/F12( Hyclone,美國(guó))；N-乙酰半胱氨酸(NAC，阿拉丁公司，中國(guó))； 二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase-1)抗體(美國(guó)Proteintech公司)；人白細(xì)胞介素(IL)-1β、人IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)ABclonal Technology公司)；β-actin抗體(美國(guó)Proteintech公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HK-2細(xì)胞株在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，換不含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于靜止生長(zhǎng)期(G0/G1期)后隨機(jī)分組：空白對(duì)照組(Con組)、溶劑對(duì)照組(DMSO組)、AST對(duì)照組(AST組)、CM組、AST預(yù)處理組(AST+CM組)、N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理組(NAC+CM組)。

1.34，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)DNA熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài) 將生長(zhǎng)于24 孔培養(yǎng)板中的大鼠腎小管上皮細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕洗3次，4%多聚甲醛(溶于0.1 mol/L PBS，pH7.4)室溫固定15 min后，再次用PBS輕洗3次×5 min，避光條件下加入3 ml DAPI(熒光性的DNA結(jié)合染料，用含0.2%Triton的PBS溶解)染色5～10 min，PBS沖洗3遍×5 min。在Olympus熒光顯微鏡上，以400 nm為激發(fā)光，455 nm發(fā)射光觀察。

1.4Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用2 ml PBS輕輕潤(rùn)洗培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，去除PBS。將細(xì)胞重新懸浮于之前的培養(yǎng)基中或預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中使其細(xì)胞濃度大約為1×106細(xì)胞/ml。取500 μl細(xì)胞懸液(5×105個(gè)細(xì)胞)至1個(gè)干凈的離心管中，離心1 000 r/min×5 min，去上清，加入500 μl PBS洗滌細(xì)胞1次，離心，去上清。再加入500 μl的1×結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞1次，離心，去上清；加入100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μl Annexin V-APC室溫避光反應(yīng)15 min。加入500 μl的1×結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞1次，離心，去上清；加入200 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μl PI。將樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平 以細(xì)胞接種密度為4×105/ml，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。根據(jù)分組用相應(yīng)藥物處理細(xì)胞，Con組、DMSO組無(wú)特殊處理；CM組加入Rosoup 1 μl+1 ml活性氧熒光探針(DCFH-DA)；實(shí)驗(yàn)各組處理時(shí)間到后，除Con組、DMSO組外，各實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA 1 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min。棄培養(yǎng)基，無(wú)血清培養(yǎng)基洗3遍×5 min，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。胰酶消化收集細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS，激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm。

1.6Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉，用特異性抗體進(jìn)行免疫雜交檢測(cè)，β肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照，化學(xué)發(fā)光劑顯色，最后對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描密度分析。每組重復(fù)3次。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18分泌水平 以細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，接種到12孔板上，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分組及轉(zhuǎn)染條件同前。分別于轉(zhuǎn)染后1、3、5 d收集細(xì)胞上清，應(yīng)用ELISA，檢測(cè)各組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-8表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism5.0 軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性 與Con組〔(100.00±9.21)%〕相比，DMSO組AST組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(98.41±7.03)%，(96.05±5.33)%，P>0.05〕；CM組細(xì)胞的增殖活性明顯下降〔(51.50±3.06)%，P<0.05〕。AST+CM組〔(87.17±4.62)%〕和NAC+CM組HK-2細(xì)胞增殖活性較CM組明顯增加〔(90.01±4.83)%，P<0.05〕。與NAC+CM組相比，AST+CM組HK-2細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2DAPI 熒光染色觀察各組細(xì)胞核形態(tài) 采用DAPI DNA 熒光染色的方法觀察細(xì)胞核形態(tài)，DAPI可以和雙鏈DNA的A堿基相結(jié)合，DAPI染色后細(xì)胞核會(huì)發(fā)出淡藍(lán)白色的熒光。正常細(xì)胞的細(xì)胞核似于圓形，邊緣清晰，染色均勻且淡染。早期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮，核染色加深；晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細(xì)胞膜所包繞，即凋亡小體，細(xì)胞核DAPI染色熒光較強(qiáng)。Con組、DMSO 組和AST組，細(xì)胞核近似于圓形，邊緣清晰，染色均勻且淡染，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。CM組細(xì)胞較Con組狀態(tài)差，可見(jiàn)大量細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核深染，固縮的核呈高亮狀態(tài)，部分細(xì)胞可見(jiàn)核裂解，為凋亡細(xì)胞。與CM組相比，AST組核固縮、核深染狀態(tài)明顯改善，凋亡細(xì)胞顯著減少；NAC+CM組核固縮、核深染狀態(tài)也明顯改善，凋亡細(xì)胞減少。觀察AST+CM組與NAC+CM組中凋亡細(xì)胞比例相似。AST+CM組與NAC+CM組比較無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

2.3各組細(xì)胞ROS的表達(dá) 用FCM檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度來(lái)表明腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con組(602.14±70.09)相比，DMSO 組(663.76±93.53)和AST組ROS表達(dá)水平(506.56±81.77)無(wú)明顯變化(P>0.05)；與Con組比較，CM組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)顯著升高(2 494.33±402.56，P<0.05)。與CM組相比，AST+CM組(1 091.97±28.87)及NAC+CM組細(xì)胞內(nèi)ROS(887.29±179.45)均明顯降低(P<0.05)。AST+CM組與NAC+CM組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ROS 表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 與Con組〔(2.32±0.61)%〕相比，DMSO組〔(2.58±0.97)%〕及AST組腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率〔(2.81±0.79)%〕無(wú)明顯變化(P>0.05)；與 Con組比較，CM組細(xì)胞凋亡率〔(18.53±3.52)%〕顯著升高(P<0.05)。 AST+CM組〔(8.24±2.48)%〕、NAC+CM組細(xì)胞凋亡率〔(7.55±1.27)%〕較 CM組顯著降低(P<0.05)。 AST+CM組和NAC+CM組進(jìn)行比較，腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

2.5Western印跡檢測(cè)各組NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與Con組相比，DMSO組和AST組腎小管上皮細(xì)胞中NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；CM 組 NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)與Con組比較均顯著增加(P<0.05)。 與CM組比較，AST+CM組NAC+CM組NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)明顯減少(均P<0.05)。AST+CM組與NAC+CM組NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

圖1 各組HK-2細(xì)胞DAPI熒光染色(×200)

圖2 Annexin V/PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

表1 各組HK-2細(xì)胞 NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)、IL-1β、IL-18表達(dá)比較

1～6：Con組，DMSO組，AST組，CM組，AST+CM組，NAC+CM組圖3 各組HK-2細(xì)胞 NLRP3、caspase-3蛋白的表達(dá)

2.6ELISA KITS測(cè)各組細(xì)胞IL-1β、IL-18表達(dá) 與Con組相比，DMSO組、AST組腎小管上皮細(xì)胞中IL-1β、IL-18表達(dá)量無(wú)明顯變化(P>0.05)；與Con組相比，CM組腎小管上皮細(xì)胞中IL-1β和IL-18表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。 AST+CM組腎小管上皮細(xì)胞中IL-1β和IL-18表達(dá)量較CM組明顯減少(P<0.05)；NAC+COM組腎小管上皮細(xì)胞中IL-1β和IL-18表達(dá)量較CM組也明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3 討 論

CI-AKI是指血管內(nèi)途徑應(yīng)用含碘對(duì)比劑后出現(xiàn)的急性腎功能損害〔7〕。最常使用的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)由 2003 年及 2008 年歐洲泌尿生殖放射協(xié)會(huì)確定，即使用對(duì)比劑后48～72 h內(nèi)SCr的絕對(duì)值升高大于44.2 μmol/L(0.5 mg/dl)或相對(duì)于基線水平升高大于25%，并且排除其他導(dǎo)致腎功能急性惡化的原因〔8〕。應(yīng)用對(duì)比劑后，血肌酐通常在對(duì)比劑使用后1～2 d開(kāi)始升高，3～5 d達(dá)到高峰，7～10 d恢復(fù)到正?！?〕。

CI-AKI的危險(xiǎn)因素包括：基礎(chǔ)腎功能不全、糖尿病、高齡、高血壓、高膽固醇血癥、急性心肌梗死、血容量減少、高滲對(duì)比劑及對(duì)比劑的使用劑量等。其中基礎(chǔ)腎功能不全的患者CI-AKI的發(fā)生率明顯升高，尤其是合并糖尿病的患者〔10〕。CI-AKI的主要發(fā)病機(jī)制主要包括：(1)腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變；(2)氧化應(yīng)激；(3)細(xì)胞凋亡；(4)造影劑的直接細(xì)胞毒性；(5)免疫炎癥反應(yīng)等。一旦發(fā)生CI-AKI，不僅會(huì)增加患者腎衰竭和死亡的風(fēng)險(xiǎn)〔3,11〕，而且會(huì)顯著延長(zhǎng)患者的住院時(shí)間，增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔12〕。

AST是迄今為止發(fā)現(xiàn)的自然界中抗氧化性最強(qiáng)的物質(zhì)。AST被證明具有抗氧化活性，可作為自由基的清除劑和ROS的猝滅劑〔13～15〕。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體研究中還表現(xiàn)出有效的抗炎作用和抗凋亡作用。氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和免疫炎癥反應(yīng)是CI-AKI的常見(jiàn)病理生理學(xué)特征，因此AST可能在這種情況下具有潛在的治療作用。許多研究證明，AST對(duì)各種腎臟疾病具有預(yù)防作用〔16～20〕。最近的研究表明，AST的抗氧化活性在各種腎毒性藥物如黏菌素，順鉑和次氮基三乙酸鐵誘導(dǎo)的急性腎損傷中起保護(hù)作用〔21～23〕。Kim等〔24〕證實(shí)，在AST可以通過(guò)清除自由基減輕高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。與本研究一致，本研究結(jié)果顯示，CM損傷后，細(xì)胞增殖活性受到抑制，AST預(yù)處理后可以改善細(xì)胞增殖活性，緩解CM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。研究結(jié)果證實(shí)，細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)機(jī)制參與了CM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的發(fā)生；AST可以通過(guò)改善細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減輕CM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷。

NLRP3能夠通過(guò)細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)與caspase-1組成多蛋白復(fù)合體，即NLRP3炎癥小體〔25〕。NLRP3炎癥小體在機(jī)體受到外界刺激時(shí)能夠感受多種微生物產(chǎn)物和代謝性應(yīng)激使NLRP3 炎癥小體激活，進(jìn)而激活caspase-1，由活化的caspase-1作為效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)下游的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)〔26,27〕。人體內(nèi)多種細(xì)胞內(nèi)均有 NLRP3 炎癥體的表達(dá)，如單核細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)〔28,29〕。研究顯示，NLRP3炎性小體及其介導(dǎo)的下游細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，在CI-AKI的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔30,31〕。對(duì)比劑可以作為PAMP激活NLRP3炎癥小體，對(duì)比劑干預(yù)后腎組織細(xì)胞內(nèi)的NLRP3表達(dá)水平顯著提高，參與腎組織的炎癥反應(yīng)，從而引起腎臟組織細(xì)胞的損傷〔32〕。在NLRP3基因敲除的小鼠中對(duì)比劑引起的腎損傷顯著減輕。這提示，NLRP3炎癥小體可以作為防治對(duì)比劑急性腎損傷藥物研究的重要靶點(diǎn)〔30〕。本研究與上述研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，AST是通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路發(fā)揮作用的。

ROS目前被認(rèn)為是激活NLRP3炎癥復(fù)合物的關(guān)鍵分子之一，ROS可以通過(guò)特有的途徑誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的組裝和激活〔33～35〕。AST作為自然界最強(qiáng)的抗氧化劑，其抗氧化性是維生素E的數(shù)百倍，AST能夠有效抑制ROS產(chǎn)生〔36〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：CM組HK-2細(xì)胞內(nèi) ROS 含量顯著升高；AST預(yù)處理后HK-2細(xì)胞內(nèi)ROS活性明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)我們的推測(cè)，AST是通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)對(duì)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的抑制作用，從而減輕碘海醇誘導(dǎo)的人HK-2的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡損傷。為了進(jìn)一步證實(shí)，我們應(yīng)用了ROS的特異性抑制劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制ROS的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了AST是通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生，從而抑制NLRP3炎癥小體及其下游的細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，減輕CM誘導(dǎo)的HK-2的損傷。