程會賢 陳名園 陳婷婷 張燕 王梅 劉天民 況薇 王巍

卵巢高級別漿液性癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSC）是卵巢癌中發(fā)病率最高的組織學(xué)類型[1]。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）包括CD4陽性（CD4+）T細(xì)胞、CD8陽性（CD8+）T細(xì)胞、NK細(xì)胞等多個細(xì)胞亞群，對于腫瘤的發(fā)展、預(yù)后及治療至關(guān)重要。本課題組前期的研究顯示，CD8+TIL與多種腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，在HGSC研究中亦得到相似的結(jié)果[2]。Webb等[3]研究發(fā)現(xiàn)，僅位于卵巢癌腫瘤上皮內(nèi)的CD8+TIL與患者預(yù)后相關(guān)，這可能與上皮內(nèi)CD8+TIL具有免疫記憶性有關(guān)。

記憶T細(xì)胞是腫瘤免疫記憶的主要細(xì)胞群體，包括中央記憶、效應(yīng)記憶和組織駐留記憶T細(xì)胞（tissue resident memory T cells, TRM）。TRM較中央、效應(yīng)記憶T細(xì)胞的免疫反應(yīng)更迅速強烈，且具有組織駐留特性，可長期在腫瘤組織局部持續(xù)發(fā)揮效應(yīng)[4]。TRM包括CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞，CD103為TRM細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，與其配體E-鈣黏蛋白（E-cadherin）結(jié)合在TRM介導(dǎo)其組織駐留中起到重要作用[4-5]。研究顯示，CD103陽性（CD103+）TIL可改善食管癌[6]等實體腫瘤的預(yù)后，但對于CD103+TIL在卵巢癌中的表達(dá)尚未明確。因此，本研究旨在通過CD103+TIL在經(jīng)初次腫瘤減滅術(shù)（primary debulking surgery，PDS）或新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NACT）的HGSC患者中的表達(dá)情況探討其與治療、預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 回顧性分析2018年6月至2019年6月四川大學(xué)華西第二醫(yī)院收治的191例術(shù)后病理診斷為HGSC患者的臨床病理資料，排除非原發(fā)卵巢癌、多發(fā)腫瘤、未行完全分期手術(shù)、術(shù)后未行化療、失訪患者54例，最終納入137例，分為PDS組83例和NACT組54例。

1.1.2 主要試劑 免疫組織化學(xué)法一抗試劑包括：兔CD103單抗（稀釋比例1∶3 000）、鼠CD8單抗（稀釋比例1∶200）、兔CD4單抗（稀釋比例1∶1 000）、Ecadherin（即用型抗體），CD103、CD8、CD4一抗試劑均夠自英國Abcam公司；二抗試劑與DAB酶底物顯色試劑、E-cadherin抗體均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。免疫熒光共染法中，封閉液為5%山羊血清購自愛必信上海生物科技有限公司；一抗試劑為兔CD103單抗（稀釋比例1∶50）、鼠CD8單抗（稀釋比例1∶100），二抗試劑為羊抗兔488單抗（稀釋比例1∶500）、羊抗鼠647單抗（稀釋比例1∶200），均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 對每例患者的石蠟包埋組織選取1個位點，制成組織芯片（tissue microarray，TMA），單個芯片直徑為2 mm，共制成6個蠟塊。每個蠟塊有30個位點（5行×6列），行5 μm厚連續(xù)切片5張。隨機選取4個高倍鏡下（×400）視野行CD103+TIL、CD8 +TIL、CD4+TIL計數(shù)，并求其平均值，細(xì)胞數(shù)高于平均值則為高浸潤（記為high），低于平均值（記為low），并行進(jìn)一步CD103highCD8highTIL、CD103lowCD8highTIL、CD103lowCD8lowTIL分組。TIL分布定位：1）腫瘤上皮內(nèi)浸潤：定義為癌細(xì)胞巢內(nèi)或與癌細(xì)胞直接接觸的TIL；2）間質(zhì)浸潤：定義為間質(zhì)區(qū)域內(nèi)未與癌細(xì)胞直接接觸的TIL[3]。

1.2.2 免疫熒光共染法 采用免疫熒光共染間接法對組織芯片進(jìn)行染色，使用LSM 980激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）進(jìn)行觀察，綠色熒光為CD103+TIL，紅色熒光為CD8+TIL。

1.2.3 隨訪 通過電話和門診進(jìn)行隨訪，隨訪時間為24～36個月。術(shù)后病理確診至患者復(fù)發(fā)、死亡或最后1次隨訪時間為無進(jìn)展生存時間（progression-free survival，PFS）。截至2021年6月。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用χ2檢驗或Mann-Whitney檢驗，相關(guān)性采用Spearman檢驗；采用Kaplan-Meier檢驗行單因素生存分析，采用Cox比例風(fēng)險回歸模型行多因素生存分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

PDS組和NACT組患者的術(shù)后復(fù)發(fā)、死亡分別為36例和14例。兩組患者其他臨床病理特征見表1。

表1 患者的臨床病理特征

2.2 兩組患者CD103+TIL、CD8+TIL、CD4+TIL與臨床病理特征的關(guān)系

PDS組患者腫瘤上皮內(nèi)CD103+TIL、CD8+TIL、CD4+TIL與臨床病理特征均無顯著性相關(guān)（P＞0.05）。NACT組患者腫瘤上皮內(nèi)CD103+TIL、CD8+TIL高浸潤患者的化療敏感性較高（P=0.03、P=0.018），而CD4+TIL與臨床特征均無顯著性相關(guān)（P＞0.05）。

Spearman相關(guān)性檢驗發(fā)現(xiàn)，CD103+TIL表達(dá)與CD8+TIL具有顯著性相關(guān)（r=0.878，P＜0.01），但與CD4+TIL無顯著性相關(guān)（r=0.211，P=0.013）。CD103+TIL與腫瘤細(xì)胞表面E-cadherin表達(dá)無顯著性相關(guān)（r=0.065，P=0.451）。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測兩組患者的陽性細(xì)胞計數(shù)

免疫組織化學(xué)法檢測顯示，NACT組CD103+TIL（P=0.026）及CD8+TIL （P=0.029）數(shù)量高于PDS組，PDS組和NACT組中的E-cadherin陽性表達(dá)率為96.39%（80/83）和94.44%(51/54）。見表2和圖1，2。

表2 免疫組織化學(xué)法檢測兩組患者的陽性細(xì)胞計數(shù)

2.4 免疫熒光共染法檢測兩組患者腫瘤上皮內(nèi)CD103+TIL和CD8+TIL染色

免疫熒光共染法檢測顯示，除個別細(xì)胞外，CD103+TIL細(xì)胞膜多出現(xiàn)CD103和CD8分子雙陽性表達(dá)（細(xì)胞膜呈黃色熒光），CD8陰性TIL表面則無CD103表達(dá)。同時可見部分CD8+TIL無CD103表達(dá)，即并非所有CD8+TIL均可表達(dá)CD103（圖3）。

2.5 單因素生存分析

PDS組的中位PFS為26.0（2.0～36.0）個月，NACT組的為20.0（7.0～36.0）個月。PDS組和NACT組患者的腫瘤上皮內(nèi)CD103+TIL、CD8+TIL高浸潤表達(dá)均具有預(yù)后意義（P=0.018、P= 0.004和P=0.012、P=0.005，圖4）。根據(jù)腫瘤上皮內(nèi)CD103+TIL、CD8+TIL表達(dá)情況，進(jìn)一步分為CD103highCD8highTIL、CD103lowCD8highTIL、CD103lowCD8lowTIL組，PDS組和NACT組的腫瘤上皮內(nèi)CD103highCD8highTIL組預(yù)后均最佳（P=0.013和P=0.036，圖5）。

2.6 Cox比例風(fēng)險回歸模型多因素生存分析

CD103+TIL高浸潤（HR=0.085，95%CI：0.011～0.645，P=0.017），腫瘤上皮內(nèi)CD103highCD8highTIL（HR=0.020，95%CI：0.002～0.201，P=0.001），化療敏感性（HR=19.903，95%CI：9.492～41.733，P＜0.01），F(xiàn)IGO分期（HR=12.023，95%CI：1.143～126.442，P=0.038）是HGSC患者獨立預(yù)后因素。

3 討論

TIL是腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中一群具有異質(zhì)性的淋巴細(xì)胞，其組成包括CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等多種不同的細(xì)胞亞群，在腫瘤治療、預(yù)后與轉(zhuǎn)歸中扮演不同的角色，其中CD8+TIL是主要的抗腫瘤細(xì)胞[2]。但有研究發(fā)現(xiàn)，HGSC預(yù)后與腫瘤間質(zhì)中CD8+TIL無關(guān)，僅與腫瘤上皮內(nèi)CD8+TIL表達(dá)水平相關(guān)，推測腫瘤上皮內(nèi)CD8+TIL是具有外周組織駐留特性的記憶性T細(xì)胞亞群（即TRM）[3]。TRM是機體屏障部位的“第一道防線”，通過釋放多種促炎因子和趨化因子以及直接釋放穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒性分子來發(fā)揮免疫效應(yīng)[4]。CD103為TRM的表面標(biāo)志物，研究顯示CDl03+TIL可改善多種腫瘤患者的預(yù)后，而且在不同腫瘤中CDl03+TIL可表達(dá)于CD4+T或CD8+T細(xì)胞亞群[6-7]。對于HGSC中的CD103表達(dá)于何種T細(xì)胞、在腫瘤中如何分布以及CD103+TIL表達(dá)水平對患者的預(yù)后影響需深入了解。

正常情況下，人體內(nèi)TRM主要包括CD8+T細(xì)胞及CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞主要位于組織上皮層，CD4+T細(xì)胞則多在固有層及間質(zhì)中存在[4]。目前，CD8+TRM細(xì)胞的發(fā)生與維持機制尚未明確，推測是由循環(huán)中CD8+T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，在TME影響下表達(dá)CD103的不同水平，與腫瘤細(xì)胞表面E-cadherin相結(jié)合，將CD8+TIL錨定于腫瘤局部成為CD8+TRM，持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，CD8+TIL在腫瘤上皮內(nèi)表達(dá)水平高于間質(zhì)，而CD4+TIL則主要分布于腫瘤間質(zhì)，且總數(shù)也明顯少于CD8+TIL；CD103+TIL大量分布于腫瘤上皮內(nèi)，間質(zhì)中偶見表達(dá)，通過免疫熒光共染法證實CD103+TIL主要為CD8+TIL。本研究PDS組和NACT組中的腫瘤上皮內(nèi)CD8+TIL高浸潤患者預(yù)后均明顯優(yōu)于低浸潤者，而間質(zhì)中CD8+TIL表達(dá)與預(yù)后無顯著性相關(guān)。此外，兩組患者的CD4+TIL無論在腫瘤上皮內(nèi)還是間質(zhì)中均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與預(yù)后無關(guān)，這可能是由于CD4+T細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)功能，既可以輔助細(xì)胞免疫，也可以發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用[9]。本研究的多因素生存分析顯示，CD103+TIL高浸潤為HGSC獨立預(yù)后因素，基于CD103+TIL細(xì)胞膜多出現(xiàn)CD103和CD8分子雙陽性表達(dá)，且大多定位于腫瘤上皮內(nèi)，而間質(zhì)中CD103+TIL表達(dá)分布較少的情況，提示HGSC患者的TME可誘導(dǎo)CD8+TIL表達(dá)CDl03，使CD8+TIL變?yōu)镃D8+TRM長期駐留于腫瘤上皮內(nèi)，持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，NACT組患者的腫瘤上皮內(nèi)CD103+TIL和CD8+TIL表達(dá)顯著高于PDS組，且高浸潤患者具有較高的化療敏感性，提示NACT可能會通過調(diào)節(jié)CD103在CD8+TIL上的表達(dá)，一方面使長期駐留于腫瘤局部中的CD8+TIL增多，另一方面還可直接增強CD8+TIL抗腫瘤能力。Chang等[10]研究就表明，鉑類藥物可協(xié)同增強腫瘤特異性CD8+TIL細(xì)胞作用，并增加顆粒酶或穿孔素的分泌。Miyashita等[11]也證實，乳腺癌患者接受NACT后，CD8+TIL可在癌巢聚集，而免疫抑制性FOXP3+T細(xì)胞可低表達(dá)甚至缺失。上述研究提示，NACT可調(diào)節(jié)免疫平衡，激活免疫應(yīng)答而減弱免疫抑制效應(yīng)，增加CD8+TIL的抗腫瘤免疫功能。有研究顯示，CD103的配體E-cadherin可通過控制細(xì)胞黏附和運動在腫瘤抑制中發(fā)揮重要作用[12]，但本研究未發(fā)現(xiàn)NACT組的E-cadherin表達(dá)水平有明顯升高，與Wang等[13]研究結(jié)果較為一致。而另一項研究表明，CD103與Ecadherin相互作用在CD8+TIL抗腫瘤應(yīng)答中起重要作用[14]。上述研究結(jié)果至少說明下述問題：1）NACT能明顯促使CD8+TIL表達(dá)CD103；2）腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的E-cadherin能通過與CD8+TIL表面CD103相結(jié)合，使CD8+TIL長期駐留在腫瘤局部形成CD8+TRM；3）E-cadherin在腫瘤免疫中的生物學(xué)效應(yīng)可能取決于CD8+TIL錨定腫瘤局部的能力，而非直接參與免疫應(yīng)答。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CD103+TIL在HGSC具有重要抗腫瘤作用，CD103+TIL較CD8+ TIL是更佳的預(yù)后評估分子；因CD103+TIL能更直接反映與腫瘤細(xì)胞密切接觸的TIL，CD103與腫瘤細(xì)胞膜上Ecadherin相結(jié)合后介導(dǎo)CD8+ TIL定位并長期駐留于腫瘤局部成為CD8+TRM，從而持續(xù)地發(fā)揮免疫殺傷作用，CD103是CD8+TIL具有更高免疫活性的體現(xiàn)。本研究的不足之處是CD8+TRM細(xì)胞在腫瘤局部的維持、調(diào)控以及在抗腫瘤免疫中的具體生物學(xué)過程尚不清楚，還需進(jìn)行深入研究。上調(diào)CD8+TIL表面CD103表達(dá)，增加腫瘤相關(guān)CD8+TRM細(xì)胞的數(shù)量，提高免疫治療水平，可能也是抗腫瘤研究的一個新嘗試。