莊一波，楊 勇，寧晶晶

常州市第一人民醫(yī)院兒科，江蘇 常州 213004

糖尿病腎臟?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病的一種進(jìn)行性微血管并發(fā)癥，由腎小球毛細(xì)血管損傷引起。其病理表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)率降低、動(dòng)脈血壓升高等［1］。迄今為止，DKD已成為糖尿病患者預(yù)期壽命縮短的主要原因。由于糖尿病發(fā)病率的增加，DKD的年發(fā)病率在過(guò)去10年中增加了1 倍以上。目前DKD 約占終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）病例的50%［2］。DKD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，尚未明確。一般認(rèn)為足細(xì)胞損傷、減少以及蛋白尿是DKD 的主要病理因素［3］。足細(xì)胞是腎小球的先天細(xì)胞之一，從根本上充當(dāng)腎小球?yàn)V過(guò)膜的最后一道屏障。多種原因引起的足細(xì)胞損傷使腎小球?yàn)V過(guò)膜的通透性增加，導(dǎo)致蛋白尿，加速腎臟疾病的進(jìn)展［4］。血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondins，TSP）是一組多域糖蛋白，存在于胚胎的細(xì)胞外基質(zhì)中。它們通過(guò)與受體分子結(jié)合而負(fù)責(zé)細(xì)胞?細(xì)胞相互作用和細(xì)胞?基質(zhì)相互作用［5］。TSP有5個(gè)家族成員，其中TSP?4是一種細(xì)胞外鈣結(jié)合蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、黏附和組織重塑等多種功能［6］。TSP?4在保護(hù)心臟中發(fā)揮重要作用，包括心肌組織重塑和心肌肥大的預(yù)防。它也是一種與癌癥相關(guān)的調(diào)節(jié)劑。TSP?4可通過(guò)觸發(fā)血管生成，可作為治療癌癥的新靶點(diǎn)。此外，TSP?4還具有調(diào)節(jié)肌腱和骨骼肌的結(jié)構(gòu)和功能的作用。文獻(xiàn)報(bào)道了TSP?4在加速瘢痕形成和介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)中的作用［7-8］。目前TSP?4 在DKD 中的作用機(jī)制研究較少。本研究旨在探討TSP?4在高糖（high glucose，HG）誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的作用及其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠足細(xì)胞系（ATCC，美國(guó)），RPMI 1640 培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶（HyClone 公司，美國(guó)），胎牛血清（Gibco 公司，美國(guó)），TRIzol、Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司，美國(guó)）。鼠抗TSP?4 多克隆抗體（R&D 公司，美國(guó)），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced che?miluminescence，ECL）試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit?8，CCK?8）、5?乙炔基?2’脫氧尿嘧啶核苷（5?ethynyl?2’?deoxyuridine，EdU）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Hoechst 33342試劑盒、RIPA裂解液、葡萄糖、兔抗信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）多克隆抗體、兔抗p?STAT3 多克隆抗體和抗β?actin 單克隆抗體等（上海碧云天生物技術(shù)公司），STAT3 激動(dòng)劑Colivelin（Selleck 公司，美國(guó)），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real?time quantitative PCR，qRT?PCR）試劑盒（TaKaRa公司，日本），Annexin V?FITC（BD Biosciences 公司，美國(guó)），EdU溶液、酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）使用試劑盒（南京建成生物工程研究所），2’，7’?二氯熒光素二乙酸酯（2’，7’?dichloro?fluorescin diacetate，DCFH?DA）（Sigma 公司，美國(guó)），電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一公司），凝膠成像系統(tǒng)（Bio?Rad 公司，美國(guó)），雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Pro?mega 公司，美國(guó)），高速低溫離心機(jī)器（Eppendrof 公司，德國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

小鼠足細(xì)胞系在RPMI164037℃培養(yǎng)，以30mmol/L葡萄糖刺激作為HG 組，5 mmol/L 葡萄糖誘導(dǎo)作為陰性對(duì)照組。使用Lipofectamine 2000 常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。接種在24 孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)至30%～50%。6 h更換新鮮培養(yǎng)基。48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

使用TRIzol 收集總RNA。使用商業(yè)試劑盒從總RNA 的逆轉(zhuǎn)錄中獲得cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix將其用作qRT?PCR的模板。95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃10 s 變性，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s循環(huán)40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參，相對(duì)水平采用2-ΔΔCT法計(jì)算。GAPDH 的序列為5′?AGGTCGGTGT?GAACGGATTTG?3′（正向）和5′?GGGGTCGTTGATG?GCAACA?3′（反向），TSP?4的序列為5′?ACCGACAG?TAGAGATGGTCTTCC?3′（正向）和5′?CGTCACAT?CTGAAGCCAGGAGA?3′（反向）。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法

細(xì)胞裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，使用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，制備蛋白質(zhì)樣品用于SDS?PAGE（每泳道30 μg）并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在特定條件下阻斷膜上的非特異性抗原后，用一抗［抗TSP?4（1∶2 000）、抗STAT3（1∶2 000）和抗p?STAT3（1∶2 000）］和二抗（1∶5 000）。使用ECL方法檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme?linked immuno?sorbent assay，ELISA）

收集細(xì)胞上清液，5 000 r/min、4 ℃離心10 min。按照推薦使用ELISA 試劑盒檢測(cè)促炎因子的相對(duì)水平。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)

PBS洗滌后，離心細(xì)胞并重懸。在黑暗中用10 μL Annexin V?FITC 誘導(dǎo)細(xì)胞，然后1 000 r/min 離心5 min。重懸的沉淀劑在4 ℃避光下用5 μL PI 進(jìn)一步誘導(dǎo)。使用流式細(xì)胞術(shù)在30 min 內(nèi)檢查凋亡細(xì)胞。通過(guò)PI染色類似地檢查細(xì)胞周期分布。

1.2.6 CCK?8檢測(cè)

細(xì)胞接種于96孔板中，接種量為3×103個(gè)/孔?？瞻捉M只填充培養(yǎng)基。在指定時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10 μL CCK?8溶液，培養(yǎng)4 h。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的光密度值。

1.2.7 EdU檢測(cè)

將細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。使用EdU溶液染色，Hoechst 33342用于在黑暗中染色細(xì)胞核。捕獲了EdU 染色的細(xì)胞（紅色）、Hoechst 33342 染色的細(xì)胞核（藍(lán)色）以及合在一起的細(xì)胞圖像。

在妊娠前半期，支持胎兒腦神經(jīng)發(fā)育的甲狀腺激素主要來(lái)自母體。妊娠期患有甲狀腺疾病的患者也要攝取足夠的碘，食用加碘食鹽是最好的方法?；加凶陨砻庖呒谞钕傺缀图谞钕俟δ軠p退的妊娠婦女，還要定期監(jiān)測(cè)甲狀腺功能。

1.2.8 MDA、SOD和CAT的測(cè)量

MDA、SOD和CAT的相對(duì)水平使用試劑盒按照建議進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 活性氧（reactive oxygen species，ROS）的測(cè)量

DCFH?DA 方法測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。分別測(cè)量了485 nm 發(fā)射波長(zhǎng)和530 nm 發(fā)射波長(zhǎng)下的光密度。

1.2.10 染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipi?tation，ChIP）

2×107個(gè)細(xì)胞用1%甲醇裂解，超聲處理制備200～1 000 bp 的DNA 片段。細(xì)胞裂解物與1 μg 抗IgG 或抗STAT3 一起孵育。然后在4 ℃下在20 μL蛋白A/G 免疫沉淀磁珠中誘導(dǎo)染色質(zhì)上清液過(guò)夜。第2 天，蛋白質(zhì)?DNA 復(fù)合物被洗脫和純化，獲得的DNA樣品進(jìn)行qRT?PCR。

1.2.11 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將接種在96 孔板中的細(xì)胞與含有野生型或突變型TSP?4啟動(dòng)子和STAT3的小干擾RNA（small in?terfering?STAT3，si?STAT3）/陰性siRNA 序列（si?neg?ative control，si?NC）的pGL3熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)用于測(cè)量相對(duì)熒光素酶活性，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Western blot 圖像的數(shù)據(jù)提取使用Image Lab 軟件。使用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組間的對(duì)比在正態(tài)性檢驗(yàn)之后用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中TSP?4的上調(diào)

檢測(cè)HG 誘導(dǎo)0、24、48、72 h 的足細(xì)胞中TSP?4的表達(dá)水平。結(jié)果表明，TSP?4的核酸（圖1A）和蛋白質(zhì)水平（圖1B、C）均呈時(shí)間依賴性上調(diào)，在72 h達(dá)到峰值。

圖1 HG呈時(shí)間依賴性誘導(dǎo)足細(xì)胞中TSP?4的表達(dá)Figure 1 Upregulation of TSP?4 in HG?induced podocytes

2.2 干擾TSP?4抑制HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡

足細(xì)胞凋亡是DKD 發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要事件。我們發(fā)現(xiàn)在足細(xì)胞中，HG 降低了細(xì)胞活力和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞比例（圖2A～C）。有趣的是，我們應(yīng)用siRNA 干擾了TSP?4 后，細(xì)胞活力和EdU 陽(yáng)性細(xì)胞顯著高于對(duì)照組，表明干擾TSP?4 后促進(jìn)了足細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明HG刺激增加了G1期的細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞比例，但是應(yīng)用si?TSP 后會(huì)抑制這種情況（圖2D、E）。因此，抑制TSP?4的表達(dá)可以阻斷HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

圖2 干擾TSP?4抑制HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡Figure 2 Knockdown of TSP?4 inhibits HG?induced apoptosis in podocytes

2.3 干擾TSP?4可減輕HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激有助于DKD的惡化。為了確定TSP?4對(duì)HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，我們使用DCF?DA 方法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。結(jié)果表明HG 誘導(dǎo)ROS 的表達(dá)，可被si?TSP?4 逆轉(zhuǎn)（圖3A）。此外，還檢測(cè)了MDA、SOD 和CAT 的相對(duì)表達(dá)水平。HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞中MDA 表達(dá)升高，SOD 和CAT活性降低，與HG誘導(dǎo)ROS的表達(dá)變化一致，從而進(jìn)一步證明HG誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激。但它們的水平均可通過(guò)si?TSP?4來(lái)逆轉(zhuǎn)（圖3B～D）。

圖3 干擾TSP?4減輕HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞氧化應(yīng)激Figure 3 Knockdown of TSP?4 alleviates oxidative stress in HG?induced podocytes

2.4 干擾TSP?4抑制HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥反應(yīng)

我們通過(guò)檢測(cè)促炎因子的相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)一步檢查了TSP?4 在HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的潛在作用。HG 上調(diào)足細(xì)胞中IL?1β、TNF?α和IL?6的表達(dá)水平，并且應(yīng)用si?TSP?4 后它們的表達(dá)水平降低（圖4）。因此，干擾TSP?4可有效抑制HG誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

2.5 STAT3激活TSP?4的轉(zhuǎn)錄

使用JASPAR 預(yù)測(cè)TSP?4 啟動(dòng)子區(qū)域中的潛在結(jié)合位點(diǎn)與STAT3結(jié)合（數(shù)據(jù)未顯示）。STAT3是一種經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子，它通過(guò)靶向基因表達(dá)來(lái)介導(dǎo)基因表達(dá)。發(fā)現(xiàn)p?STAT3 在HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞中呈時(shí)間依賴性上調(diào)（圖5A、B）。加入STAT3 激動(dòng)劑Colivelin 后，TSP?4 的表達(dá)水平明顯上調(diào)，抑制STAT3 的表達(dá)可顯著下調(diào)TSP?4（圖5C、D），表明STAT3可能介導(dǎo)TSP?4的轉(zhuǎn)錄。推測(cè)STAT3通過(guò)直接結(jié)合其啟動(dòng)子來(lái)激活TSP?4 的表達(dá)水平。通過(guò)ChIP 檢測(cè)分析，證實(shí)STAT3 蛋白能夠與TSP?4 的啟動(dòng)子結(jié)合（圖5E）。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)闡明STAT3 激活了野生型TSP?4 的啟動(dòng)子，而不是突變型1（圖5F、G）。故足細(xì)胞中的TSP?4 可以被STAT3激活。

圖5 STAT3激活TSP?4的轉(zhuǎn)錄Figure 5 STAT3 activates the transcription of TSP?4

3 討論

DKD的全球死亡率相對(duì)較高。更重要的是，隨著發(fā)病率的逐年增加，醫(yī)療費(fèi)用增多。DKD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜且不確定，涉及多種類型細(xì)胞和各種因素［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，TSP?4 在HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞中顯著上調(diào)，從而加劇了足細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)。文獻(xiàn)報(bào)道HG刺激導(dǎo)致細(xì)胞中大量產(chǎn)生晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE），并不斷積累［11］。同時(shí)，在AGE的產(chǎn)生過(guò)程中，線粒體會(huì)釋放大量的ROS。過(guò)量的ROS 最終會(huì)導(dǎo)致氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損。氧化應(yīng)激可直接導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，或通過(guò)肌動(dòng)蛋白重排、內(nèi)皮素?1合成增加或微血管通透性改變等間接引起足細(xì)胞凋亡［12］。本研究結(jié)果表明，HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中ROS水平顯著增加，可通過(guò)抑制TSP?4 的表達(dá)而降低。這表明抑制TSP?4 的表達(dá)發(fā)揮了抗氧化作用。

氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，它們的協(xié)同作用引發(fā)了DKD 的惡化。全身和局部炎癥反應(yīng)都參與了DKD的發(fā)展。以往研究表明，DKD患者腎臟中過(guò)量的ROS會(huì)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和募集，從而進(jìn)一步加速IL?1β、IL?6、TNF?α和NF?κB等促炎因子的產(chǎn)生，并啟動(dòng)DKD的發(fā)作［13］。血漿IL?6和TNF?α也有助于DKD 的進(jìn)展。它們能夠提高系膜細(xì)胞的增殖率，擴(kuò)大細(xì)胞外基質(zhì)，重要的是通過(guò)在正反饋回路中產(chǎn)生ROS來(lái)增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性［14］。NF?κB是啟動(dòng)糖尿病炎癥反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。它在DKD患者的腎臟中上調(diào)，可以調(diào)節(jié)黏附分子和促炎因子如MCP?1、TNF?α和IL?6 的表達(dá)水平［15］。文獻(xiàn)報(bào)道［16］ESRD 患者粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中Mac?1（CD11b/CD18）上調(diào)與血漿MDA 含量增加以及超氧化物和過(guò)氧化氫的產(chǎn)生有關(guān)，表明氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)之間存在相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)干擾TSP?4的表達(dá)可抑制HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中炎癥因子水平的增加。然而，TSP?4的相關(guān)炎癥機(jī)制尚不清楚。

STAT3位于人染色體17q21.2，通過(guò)作用于細(xì)胞表面的多肽受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［17］。它是一種參與DKD 發(fā)病機(jī)制的功能性轉(zhuǎn)錄因子。抑制STAT3活性可以減輕大鼠DKD 的發(fā)展［18］。本研究中，HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞中STAT3的磷酸化水平顯著升高，通過(guò)誘導(dǎo)TSP?4轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)了TSP?4的表達(dá)水平。

本研究存在一些局限性。應(yīng)用HG刺激足細(xì)胞形成體外DKD模型，在未來(lái)的研究中需要一個(gè)體內(nèi)DKD模型來(lái)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)。此外，雖然發(fā)現(xiàn)STAT3調(diào)節(jié)TSP?4 的表達(dá)，但TSP?4 是否負(fù)責(zé)STAT3 的功能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述，在HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞中TSP?4 上調(diào)，這可能是由STAT3 磷酸化水平增加引起的。抑制TSP?4的表達(dá)對(duì)減輕HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用。結(jié)合本研究，認(rèn)為TSP?4是DKD的一個(gè)重要的新治療靶點(diǎn)，為DKD的治療帶來(lái)了新的啟發(fā)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。