余海洋， 游德淑， 顧曉誠， 梅峻豪， 秦立昊， 王 凱， 劉 純， 王 云， 賈中芝

糖尿病足部潰瘍導(dǎo)致的創(chuàng)面新生血管形成不良、局部炎性反應(yīng)、血小板聚集等加重了創(chuàng)面局部細(xì)胞損傷，進(jìn)而形成難治性創(chuàng)面，已成為臨床上棘手的難題［1-3］。 芍藥苷是一種中藥單體成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、保護(hù)細(xì)胞活性、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，廣泛應(yīng)用于臨床［4-6］。 近年來，生物3D 打印技術(shù)逐漸應(yīng)用于人工皮膚支架制備［7-9］。本研究采用生物3D 打印技術(shù)， 將芍藥苷與海藻酸鈉（sodium alginate，SA）、明膠制成人工皮膚支架，并對(duì)其生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為糖尿病足部慢性創(chuàng)面的修復(fù)提供一種中藥生物3D 打印皮膚支架， 促進(jìn)糖尿病足部慢性創(chuàng)面愈合。

1 材料與方法

1.1 皮膚支架制備

生物墨水制備：將一定量的芍藥苷完全溶解于20 mL 去離子水，然后加入0.8 g SA 粉末及裝有2 g明膠顆粒的燒杯中，40℃水浴電磁攪拌2 h，按照芍藥苷的質(zhì)量占明膠與SA 總重百分比（wt%）分別制成0、1、3、5、10%的生物3D 打印墨水。

采用生物3D 打印機(jī)（瑞士RegenHU 公司）及其配套BioCAD 軟件設(shè)計(jì)的模型（15 mm×15 mm，厚度4 層，間距0.8 mm），將生物墨水加入3D 打印機(jī)熱熔針筒中，針筒加熱至40 ℃，然后調(diào)節(jié)為37℃恒溫，氣壓0.25 MPa，距離2 mm，打印速度6 mm/s，針頭25 G，分別打印出0、1、3、5、10%芍藥苷-SA-明膠的皮膚支架。

1.2 皮膚支架藥物釋放

將透析袋（截留相對(duì)分子量3 500）置于沸水中煮10 min，待其活化后剪成半透膜，固定于擴(kuò)散池的供給池與接受池之間； 向接受池中加入14.8 mL已預(yù)熱至35℃的0.9%氯化鈉溶液作為接受液，注意排除氣泡。轉(zhuǎn)速為200 r/min，向供給池中加3 mL 0.9%氯化鈉溶液并封口， 將樣品浸在200 μL 0.9%氯化鈉溶液中，30 min 后供給池中加完0.9%氯化鈉溶液及處理后的樣品35 mg，立刻啟動(dòng)透皮儀并開始計(jì)時(shí)； 分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h 時(shí)點(diǎn)取出0.6 mL 接受液，置于離心管中，加入0.6 mL 35℃0.9%氯化鈉溶液并排除氣泡。 樣品12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm 濾膜后用液相色譜儀檢測(cè)。 色譜條件：①流動(dòng)相，甲醇∶0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為32∶68； ②檢測(cè)波長(zhǎng)，230 nm；③流速，1.0 mL/min；④柱溫，30℃。

1.3 皮膚支架生物相容性

將皮膚支架與大鼠皮膚成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)3 d后，行Live/Dead 染色，熒光顯微鏡下觀察皮膚支架表面細(xì)胞存活和黏附情況， 掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察皮膚支架表面細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)情況。

將大鼠皮膚成纖維細(xì)胞與皮膚支架置入24 孔板中，4×104/孔密度種植，共培養(yǎng)1、2、3 d，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK）-8 中檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；檢測(cè)羥脯氨酸和白細(xì)胞介素（IL）-6 表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，最后取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚支架宏觀和微觀結(jié)構(gòu)

肉眼觀：5 種規(guī)格皮膚支架均呈網(wǎng)格狀，孔徑均勻（圖1）。 SEM：5 種規(guī)格皮膚支架均為多孔網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)， 孔隙均勻，3%組皮膚支架表面較其他4 組光滑（圖2）。

圖1 不同規(guī)格芍藥苷-SA-明膠皮膚支架的宏觀形貌

2.2 皮膚支架藥物釋放

藥物累積釋放量隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，10 %皮膚支架組在各時(shí)點(diǎn)的釋放均高于其他4 組（圖3）。

2.3 皮膚支架細(xì)胞黏附和增殖

Live/Dead 染色： 細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)3 d后， 在各組皮膚支架表面均能較好地黏附與生長(zhǎng)，但3%組皮膚支架活細(xì)胞數(shù)多于其他4 組；SEM：細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)3 d 時(shí)， 細(xì)胞能在皮膚支架表面黏附和生長(zhǎng)，見圖4。

圖3 皮膚支架藥物釋放曲線

圖2 SEM 下不同規(guī)格芍藥苷-SA-明膠皮膚支架的表面形貌

圖4 大鼠皮膚成纖維細(xì)胞在5 組皮膚支架表面生長(zhǎng)情況

CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖率： 在1 d 時(shí)，0、1、3、5、10%組分別為（0.47±0.04）%、（0.39±0.02）%、（0.39±0.01）%、（0.38±0.02）%、（0.39±0.02）%，0 組顯著高于1、3、5、10%組（P=0.045、0.035、0.032、0.032），1、3、5、10%組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；2 d 時(shí)，0、1、3、5、10%組分別為（0.54±0）%、（0.41±0.02）%、（0.40±0.02）%、（0.41±0.01）%，0 組顯著高于其他4 組（均P＜0.01），1、3、5、10%組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；3 d 時(shí)，0、1、3、5、10%組分別為（0.74±0.01）%、（0.74±0.05）%、（0.85±0.05）%、（0.7±0.05）%、（0.56±0.04）%，3%組顯著高于0、1、5、10%組（P=0.022、0.048、0.020、0.002），見圖5。

圖5 大鼠皮膚成纖維細(xì)胞增殖水平

2.4 皮膚支架對(duì)羥脯氨酸分泌的影響

細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)后羥脯氨酸分泌水平：1 d 時(shí)，0 組［（2.51±0.03） μg/mL］顯著低于3%組［（2.73±0.06）μg/mL，P=0.006］、5%組［（2.77±0.12）μg/mL，P=0.020］；2 d 時(shí)，0 組［（4.21±0.10） μg/mL］顯著低于1%組［（5.19±0.28） μg/mL，P=0.005］、3%組［（5.13±0.23） μg/mL，P=0.003］、5%組［（4.79±0.33） μg/mL，P=0.043］、10 %組［（5.11±0.10） μg/mL，P＜0.01］；3 d 時(shí)，3%組［（6.24±0.34） μg/mL］顯著高于0 組［（4.93±0.12）μg/mL，P=0.003］、1%組［（5.66±0.17）μg/mL，P=0.030］、5%組［（5.28±0.17） μg/mL，P=0.012］、10%組［（5.34±0.41） μg/mL，P=0.042］，見圖6。

圖6 羥脯氨酸分泌水平

2.5 皮膚支架對(duì)IL-6 分泌的影響

細(xì)胞與皮膚支架共培養(yǎng)后IL-6 表達(dá)水平：1 d時(shí)，0、1、3、5、10%組分別為（141.77±16.19） pg/mL、（150.32±0.69）pg/mL、（136.77±15.03）pg/mL、（116.99±10.12） pg/mL、（56.21±8.04） pg/mL，10 %組顯著低于其他4 組（均P=0.001）；2 d 時(shí)，0、1、3、5、10%組分別為（177.88±8.00）pg/mL、（158.66±11.86）pg/mL、（146.66±14.51）pg/mL、（136.32±4.91）pg/mL、（127.21±3.34）pg/mL，0 組高于3%組、5%組、10%組（P=0.031、0.002、0.001），1 組高于5%組、10%組（P=0.040、0.011）；3 d 時(shí)，3%組［（165.1±1.73） pg/mL］顯著低于0 組［（231.21±10.59） pg/mL，P＜0.01］、1%組［（180.77±2.08） pg/mL，P ＜0.01］， 顯著高于10%組［（142.54±1.54） pg/mL，P＜0.01］，見圖7。

圖7 IL-6 表達(dá)水平

3 討論

隨著我國糖尿病患者逐年增多，糖尿病足潰瘍發(fā)病率逐年升高，其治療已成為臨床上巨大挑戰(zhàn)［10-12］。人工皮膚在糖尿病足潰瘍救治過程中發(fā)揮著重要作用［13］。近年來生物3D 打印技術(shù)飛速發(fā)展，通過該技術(shù)能快速獲得個(gè)性化的人工皮膚支架，逐漸在糖尿病足潰瘍救治方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但目前基于生物3D 打印技術(shù)獲得的皮膚支架仍處于起始階段，需要深入研究［13-14］。

生物3D 打印技術(shù)的關(guān)鍵是生物墨水選擇與制備，目前常用于生物墨水的材料有海藻酸鹽、明膠、膠原蛋白、殼聚糖等，這些材料各有優(yōu)缺點(diǎn)［7］。 本研究采用SA、明膠及芍藥苷作為生物墨水成分，主要優(yōu)點(diǎn)是：SA 作為一種天然多糖，具有高穩(wěn)定性、溶解性、黏性和安全性等特點(diǎn)［15］；明膠具有較高的生物相容性和可降解性， 其在體內(nèi)降解后不產(chǎn)生副產(chǎn)物，無免疫原性［16］；芍藥苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、保護(hù)細(xì)胞活性、免疫調(diào)節(jié)等多種作用，不但在糖尿病腎病、 糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治中得到廣泛應(yīng)用，還在糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮著重要作用［4-6］。 本研究初步驗(yàn)證了應(yīng)用SA、明膠、芍藥苷制作生物墨水，可獲得較為理想的皮膚支架。 雖然在宏觀方面無法區(qū)分5 組支架， 但在微觀結(jié)構(gòu)上，3%芍藥苷-SA-明膠皮膚支架較其他4 組支架明顯光滑，這種結(jié)構(gòu)方面的差異，可進(jìn)一步影響細(xì)胞生長(zhǎng)黏附， 從而證實(shí)3%芍藥苷-SA-明膠皮膚支架組較其他4 組支架更加適宜細(xì)胞生長(zhǎng)。

羥脯氨酸是構(gòu)成結(jié)締組織中膠原蛋白的主要成分之一，在促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面修復(fù)過程中發(fā)揮著極其重要的作用［17］。膠原蛋白具有低免疫原性、良好的生物相容性，可促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，維持新生肉芽組織彈性和強(qiáng)度等功能，其量的多少直接影響糖尿病足潰瘍創(chuàng)面修復(fù)過程［18］。本研究證實(shí)，3%芍藥苷-SA-明膠皮膚支架組羥脯氨酸分泌量顯著高于其余4 組（與前面證實(shí)的該支架更適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果一致）。 這也與芍藥苷藥物濃度有關(guān)，隨著累積釋放量增加，其抗炎作用增強(qiáng)的同時(shí)也對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的殺傷作用，細(xì)胞數(shù)量多少是影響羥脯氨酸釋放量的因素之一。 因此，3%芍藥苷-SA-明膠組皮膚支架具有較高的生物相容性， 并可促進(jìn)膠原蛋白分泌，從而加速糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合。

IL-6 是成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子之一，在炎性反應(yīng)過程中起著重要作用［19］。 炎性細(xì)胞和炎性因子浸潤(rùn)導(dǎo)致了糖尿病足潰瘍創(chuàng)面難以愈合。 本研究發(fā)現(xiàn)10%芍藥苷-SA-明膠皮膚支架的IL-6 表達(dá)水平顯著低于其余4 組， 說明芍藥苷可很好地抑制IL-6 釋放，減輕局部炎癥反應(yīng)，但其細(xì)胞毒性也隨著藥物濃度的增加而增大［20］，而3%芍藥苷-SA-明膠皮膚支架在降低局部炎癥反應(yīng)的同時(shí)具有較低的細(xì)胞毒性，可有效抑制支架局部炎癥反應(yīng)，從而加快糖尿病足潰瘍創(chuàng)面修復(fù)。

糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合是一極其復(fù)雜的過程，包括抑制炎癥反應(yīng)、膠原蛋白沉積、新生表皮成纖維細(xì)胞增殖、血運(yùn)重建等［21］。 本研究針對(duì)影響糖尿病足潰瘍修復(fù)的主要因素進(jìn)行的體外研究，發(fā)現(xiàn)3%芍藥苷-SA-明膠皮膚支架可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白釋放，同時(shí)可有效抑制炎癥反應(yīng)，希望可為糖尿病足潰瘍創(chuàng)面修復(fù)提供一種理想的皮膚支架。

本研究不足：僅進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，未進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，下一步將開展糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)， 以驗(yàn)證以上理論；SEM 下觀察5 組皮膚支架上的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可能與皮膚支架的脫水處理會(huì)引起細(xì)胞脫落有關(guān)；3%芍藥苷-SA-明膠皮膚支架的降解時(shí)間曲線，仍需要進(jìn)一步研究。