張 克， 楊 濤， 郝 斌

下肢動脈硬化閉塞癥（lowerextremityatherosclerotic occlusive disease，LEAOD）是下肢動脈粥樣硬化斑塊堵塞血管，致使下肢慢性缺血、缺氧的綜合征［1］。血管內(nèi)介入治療作為一種微創(chuàng)術(shù)式，已廣泛應(yīng)用于LEAOD 治療，可有效改善肢體缺血、缺氧情況［2］。 但經(jīng)長期臨床觀察，LEAOD 患者經(jīng)血管內(nèi)介入治療后支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR）發(fā)生率較高，普通金屬支架ISR 發(fā)生率在15%～30%，即使應(yīng)用藥物洗脫支架，其ISR 發(fā)生率也在10%左右［3］。 因此，探究預(yù)示ISR 的指標(biāo)有著重要意義。 目前關(guān)于ISR 病理生理機(jī)制還未完全闡明， 可能與血管內(nèi)皮損傷、動脈粥樣硬化、炎癥、血管平滑肌細(xì)胞異常增殖和遷移等有關(guān)［4］。 有研究顯示， 微小核糖核酸（miR）-140-5p 可靶向toll 樣受體4， 抑制氧化型低密度脂蛋白誘發(fā)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，干擾動脈粥樣硬化斑塊形成［5］，因而認(rèn)為miR-140-5p 參與了LEAOD 支架植入術(shù)后ISR 過程。目前鮮有研究分析miR-140-5p 與LEAOD 支架植入術(shù)后ISR 的關(guān)系。本研究選取LEAOD 患者作為研究對象， 分析miR-140-5p 與支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的關(guān)系，以期為ISR 預(yù)防和治療提供幫助。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

參照《下肢動脈硬化閉塞癥診治指南》［6］診斷LEAOD，就診患者有間歇性跛行、靜息痛或麻木等癥狀，踝-肱指數(shù)（ABI）＜0.9，經(jīng)CTA 檢查確診為LEAOD。 選取2019 年2 月至2020 年3 月在山西白求恩醫(yī)院接受支架植入術(shù)治療的136 例LEAOD 患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次確診為LEAOD；②符合支架植入手術(shù)指征；③年齡＜80 歲；④配合完成研究相關(guān)事宜。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴肝、腎功能或凝血功能異常；②伴大動脈炎、高同型半胱氨酸血癥、惡性腫瘤、慢性阻塞性肺疾病或骨關(guān)節(jié)炎等；③術(shù)后未遵醫(yī)囑服用抗血小板聚集藥物； ④臨床資料不完整。 本研究符合赫爾辛基宣言，所有受試者均簽署手術(shù)知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 支架植入術(shù)治療方案

術(shù)前行常規(guī)檢查，包括血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、凝血功能等。 采用Seldinger 法穿刺股動脈，CTA檢查后行球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)， 根據(jù)血管病變位置、 長度等選擇大小適宜的同種類型支架并植入，然后依次撤出導(dǎo)絲、導(dǎo)管，最后拔出動脈止血鞘管，局部加壓止血。術(shù)后口服氯吡格雷（75 mg/d）和阿司匹林（100 mg/d）6 個(gè)月，此后口服阿司匹林。

1.3 臨床指標(biāo)和隨訪

收集患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、糖尿病史、高血壓史、高脂血癥史、冠心病史、缺血性腦卒中史、Fontaine 分期、 泛大西洋學(xué)會聯(lián)盟（TASC）Ⅱ分型、 抗血小板聚集藥物服用情況、 空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和C 反應(yīng)蛋白（CRP）等指標(biāo)。

采用復(fù)診方式了解術(shù)后患者ISR 發(fā)生情況，每6 個(gè)月1 次，共2 次。行下肢動脈超聲檢查了解ISR和支架脫落等情況， 必要時(shí)行CTA 檢查。 共隨訪150 例患者，其中14 例失訪，失訪率為9.3%，未將失訪患者納入研究分析。 隨訪過程中無死亡患者。 ISR定義：原支架植入兩端5 mm 內(nèi)血管腔內(nèi)徑狹窄≥50%。

1.4 miR-140-5p 表達(dá)檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）［7］檢測患者血清miR-140-5p 表達(dá)。 抽取患者支架植入術(shù)前后（出院前、術(shù)后7 d）肘部靜脈血10 mL，離心后取上清液，置于Eppendorf 管（EP）中-80℃保存待驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)步驟：取出EP，解凍后用RNA 提取試劑盒（日本TaKaRa 公司）提取總RNA，紫外分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠有限公司） 檢測RNA 純度，吸光度值比（OD260/280）在1.9～2.0；取2 μg RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）將其轉(zhuǎn)錄為cDNA；用PCR 儀（美國Thermo Fisher 科技公司）擴(kuò)增cDNA，反應(yīng)條件為95℃10 min，95℃60 s，35 個(gè)循環(huán)，60℃60 s，72℃60 s。 選取10 名年齡、性別與LEAOD 患者匹配的健康體檢者作為對照，2-DDCt 法計(jì)算LEAOD 患者miR-140-5p 相對表達(dá)量。 miR-140-5p和內(nèi)參U6 序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料行Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)， 正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的以M（P25，P75）表示，兩組間比較用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；兩組間術(shù)前、術(shù)后miR-140-5p 相對表達(dá)水平比較用重復(fù)測量方差分析。 計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，兩組間比較用χ2檢驗(yàn)。 采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）評價(jià)miR-140-5p 預(yù)判支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的價(jià)值，logistic 回歸分析miR-140-5p 與支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的關(guān)系。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LEAOD 患者臨床特征

136 例LEAOD 患者中男88 例，女48 例；年齡50～78（59.9±6.1）歲；BMI 為（23.8±2.6） kg/m2；有高血壓史68 例，糖尿病史38 例，高脂血癥史106 例，冠心病史37 例，缺血性腦卒中史32 例；血管病變均位于股腘動脈段；Fontaine 分期Ⅱ期10 例， Ⅲ期88 例，Ⅳ期38 例；TASCⅡ分型A 型81 例，B 型39 例，C 型16 例。 支架植入術(shù)后1 年內(nèi)有52 例（38.24%）發(fā)生ISR（ISR 組），84 例（61.76%）未發(fā)生ISR（非ISR 組）。

2.2 兩組臨床特征比較

兩組患者年齡、性別構(gòu)成比，BMI、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、冠心病史、缺血性腦卒中史占比，F(xiàn)ontaine 分期構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 ISR 組TASCⅡ分型B+C 型占比高于非ISR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組臨床特征比較

2.3 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

兩組患者FBG、TC、TG、HDL-C 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），ISR 組LDL-C、CRP 水平高于非ISR 組（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （x±s）

2.4 兩組miR-140-5p 相對表達(dá)比較

兩組間miR-140-5p 相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=42.316，P＜0.001）；ISR 組miR-140-5p 相對表達(dá)水平在術(shù)前、術(shù)后均低于非ISR 組（均P＜0.05），術(shù)前與術(shù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=467.020，P＜0.01）；兩組術(shù)后miR-140-5p 相對表達(dá)水平均分別高于術(shù)前（均P＜0.05），其時(shí)間與ISR 間存在交互效應(yīng)（F=6.158，P=0.014）；ISR 組miR-140-5p 相對表達(dá)升高程度低于非ISR 組（P＜0.05），見表4。

2.5 miR-140-5p 預(yù)判支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 價(jià)值

術(shù)前miR-140-5p、術(shù)后miR-140-5p、miR-140-5p差值預(yù)判支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的ROC 曲線下面積（AUC）、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度、特異度，分別為0.639（95%CI：0.542～0.736）、0.58、48.08%、78.57%，0.824（95%CI：0.757～0.892）、0.94、80.77%、70.24%，0.617（95%CI：0.520～0.715）、0.28、71.15%、52.38%。術(shù)前miR-140-5p 與miR-140-5p 差值間預(yù)判支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的AUC 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.234，P=0.815）， 術(shù)后miR-140-5p 預(yù)判支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的AUC 高于術(shù)前miR-140-5p（Z=3.012，P=0.003）、miR-140-5p 差值（Z=5.274，P＜0.01），見圖1。

表4 兩組miR-140-5p 相對表達(dá)比較

2.6 支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR logistic 回歸分析

將支架植入術(shù)后1 年內(nèi)是否發(fā)生ISR 作為因變量，性別、TASCⅡ分型、LDL-C、CRP 和術(shù)后miR-140-5p 作為自變量（納入標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.10，賦值見表5）納入多因素logistic 回歸分析， 結(jié)果顯示TASCⅡ分型、LDL-C、CRP 是LEAOD 患者支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），術(shù)后miR-140-5p是術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05），見表6。

表5 自變量賦值情況

表6 logistic 回歸分析支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 結(jié)果

3 討論

ISR 嚴(yán)重影響著LEAOD 介入治療預(yù)后， 是臨床急需解決的問題之一。 探究預(yù)示ISR 的指標(biāo)有著重要意義。目前已有多數(shù)miRNA 被報(bào)道參與了LEAOD發(fā)病和進(jìn)展過程， 如miR-342-5p、miR-29a 和miR-143［8-10］等。 本研究主要分析miR-140-5p 與LEAOD患者支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的關(guān)系，結(jié)果顯示ISR發(fā)生率為38.24%，與徐永平等［11］研究結(jié)果（33.82%）接近；ISR 組術(shù)前和術(shù)后miR-140-5p 相對表達(dá)均低于非ISR 組，兩組術(shù)后相對表達(dá)均高于術(shù)前，ISR 組升高程度低于非ISR 組，提示miR-140-5p 與LEAOD患者支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 有關(guān)，或可作為輔助預(yù)判ISR 的潛在生物標(biāo)志物；ROC 曲線分析結(jié)果顯示術(shù)后miR-140-5p 預(yù)判支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR的AUC、靈敏度、特異度分別為0.824、80.77%、70.24%，其預(yù)判價(jià)值高于術(shù)前miR-140-5p 和miR-140-5p差值，提示術(shù)后miR-140-5p 對于LEAOD 患者支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 有一定預(yù)判價(jià)值，可輔助用于ISR 診斷。

進(jìn)一步采用logistic 回歸分析顯示， 術(shù)后miR-140-5p 是LEAOD 患者支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的獨(dú)立保護(hù)因素。推測其原因：miR-140-5p 可靶向toll樣受體4， 抑制氧化型低密度脂蛋白誘發(fā)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，干擾動脈粥樣硬化斑塊形成，其表達(dá)水平與動脈粥樣硬化斑塊形成有關(guān)，進(jìn)而反映支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 情況；miR-140-5p 還被報(bào)道參與多種炎癥性疾病，如骨關(guān)節(jié)炎［12］、腦出血誘發(fā)的神經(jīng)炎癥［13］等，其可能通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)參與ISR 發(fā)生過程， 因此其表達(dá)水平可反映ISR 發(fā)生情況。本研究結(jié)果還顯示TASCⅡ分型、LDL-C 和CRP均為LEAOD 患者支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與既往一些研究結(jié)果一致［14-16］；糖尿病與術(shù)后1 年內(nèi)ISR 無關(guān)， 與上述研究結(jié)果不一致，推測可能與樣本量大小、區(qū)域等因素有關(guān)，還需開展大樣本、多中心研究予以驗(yàn)證。 支架植入數(shù)量和支架直徑等因素也或與ISR 有關(guān)，但本研究未納入這些因素進(jìn)行分析，原因在于支架植入數(shù)量取決于患者血管病變支數(shù)， 支架直徑取決于血管狹窄程度，而TASCⅡ分型包含上述內(nèi)容。

圖1 miR-140-5p 預(yù)判支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的AUC

本研究尚存在一定不足，僅分析了術(shù)前、術(shù)后miR-140-5p 與LEAOD 患者支架植入術(shù)后1 年內(nèi)ISR 的關(guān)系，未確定最佳時(shí)點(diǎn)的miR-140-5p 用于診斷。 對于接受球囊擴(kuò)張治療患者術(shù)后miR-140-5p是否可用于ISR 評價(jià)仍未可知，還需開展研究予以驗(yàn)證。 本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果有略微差異，后續(xù)將開展大樣本、多中心研究進(jìn)行驗(yàn)證分析。