羅賢宇

（中國(guó)電子系統(tǒng)工程第二建設(shè)有限公司武漢分院， 武漢 430012)

近年來(lái)，隨著國(guó)外基因治療產(chǎn)品陸續(xù)獲批上市，國(guó)內(nèi)基因治療企業(yè)持續(xù)投入研究，在國(guó)家相關(guān)產(chǎn)業(yè)政策大力支持下，國(guó)內(nèi)基因治療市場(chǎng)規(guī)模迅速增長(zhǎng)，迅速擴(kuò)大的市場(chǎng)規(guī)模衍生出充足的基因治療產(chǎn)品研發(fā)需求，為CDMO企業(yè)發(fā)展提供廣闊空間?；蛑委熕幬颎MP車(chē)間的設(shè)計(jì)和建設(shè)也將迎來(lái)巨大的市場(chǎng)，目前國(guó)內(nèi)對(duì)于此類(lèi)新型藥物的GMP車(chē)間設(shè)計(jì)尚未頒布正式的法規(guī)，設(shè)計(jì)中存在不同的見(jiàn)解，特別是對(duì)于涉及生物安全多樣的AAV基因治療藥物車(chē)間，如何做好良好的工藝設(shè)計(jì)是行業(yè)的一個(gè)熱議話題。

1 AAV工藝生產(chǎn)流程

AAV生產(chǎn)工藝主要有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293系列細(xì)胞和桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞兩種，本文主要討論質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的工藝路徑。生物原液生產(chǎn)工藝流程描述如 下：

（1）種子復(fù)蘇；（2）細(xì)胞擴(kuò)增；（3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)；（4）生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)染；（5）深層過(guò)濾；（6）超濾濃縮；（7）層析1；（8）層析2；（9）置換緩沖液；（10）除菌過(guò)濾。

2 生物安全分析

2.1 生物安全定級(jí)

本項(xiàng)目涉及到的生物活性物質(zhì)主要有293細(xì)胞，質(zhì)粒、AAV病毒，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版三部）、《人間傳染的病原微生物名錄》、《NIH_Guidelines for Research lnvolving Recombinant DNA Molecules》、ATCC等規(guī)定[1-3]，就高不就低的原則，293細(xì)胞生物安全等級(jí)為BSL-2，質(zhì)粒生物安全等級(jí)為BSL-1、AAV病毒生物安全等級(jí)為BSL-2。

2.2 生物安全防護(hù)措施

生物安全主要防護(hù)措施，根據(jù)國(guó)內(nèi)外不同的法規(guī)要求[4-11]，對(duì)比主要的硬件設(shè)計(jì)要求差異，結(jié)合AAV基因治療藥物生產(chǎn)車(chē)間的特點(diǎn)（車(chē)間涉及大量病毒培養(yǎng)，且存在局部暴露操作），同時(shí)考慮防止產(chǎn)品交叉污染的問(wèn)題，建議對(duì)生產(chǎn)車(chē)間設(shè)計(jì)防護(hù)措施如表1所示。

表1 AAV基因治療藥物生產(chǎn)車(chē)間生物安全防護(hù)要求Tab.1 Biosafety protection requirements of AAV gene therapy drug production workshop

3 車(chē)間功能區(qū)劃及人物流組織

3.1 主要功能間的劃分

原液車(chē)間主要功能間劃分：根據(jù)工藝流程將（1）種子復(fù)蘇和（2）細(xì)胞擴(kuò)增等有直接細(xì)胞暴露操作的功能作為第一個(gè)功能間（接種間），同時(shí)接種間還兼有建庫(kù)功能；將（3）生物反應(yīng)器培養(yǎng)、（4）生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)染、（5）深層過(guò)濾等在生物反應(yīng)器中密閉培養(yǎng)轉(zhuǎn)染，且同空間內(nèi)存在細(xì)胞和病毒的功能作為第二個(gè)功能間（擴(kuò)增間）；將（6）超濾濃縮、（7）層析1、（8）層析2，等一系列有病毒純化操作的下游純化工藝作為第三個(gè)功能間（粗純間）；將（9）置換緩沖液（10）除菌過(guò)濾等最后一步超濾及原液灌裝作為第四個(gè)功能間（精純間）。主要功能間劃分見(jiàn)圖1。

圖1 工藝流程框圖Fig.1 Process flow diagram

3.2 主要功能間布局及工藝流線

生物原液生產(chǎn)車(chē)間功能間布局有多種模式，基于AAV生產(chǎn)從起始物料到最終原液均含有生物活性物質(zhì)，且種類(lèi)多，為避免不同產(chǎn)品和批次之間的交叉污染，參考法規(guī)的要求[12-13]，對(duì)于涉及暴露操作的功能間，每個(gè)功能間僅同時(shí)允許存在一個(gè)批次的產(chǎn)品進(jìn)行生產(chǎn)，不同功能間之間需要采取有效的措施（如密封轉(zhuǎn)移、房間壓差控制、不得跨越房間操作、人員不得交叉走動(dòng)、滅菌與消毒、單向流傳遞等），避免物料、產(chǎn)品和廢棄物的差錯(cuò)和混淆。在設(shè)計(jì)中考慮使用雙走道模式，對(duì)于主要生產(chǎn)功能間設(shè)置進(jìn)入走道和退出走道，人物進(jìn)出均實(shí)施嚴(yán)格單向流動(dòng)，人員物料均從進(jìn)入走道進(jìn)入功能間，接觸過(guò)活性物質(zhì)的人、器具、污物、潔具等均從退出走道集中退出，經(jīng)過(guò)退更、高溫滅活、化學(xué)滅活等措施退出生產(chǎn)車(chē)間。具體的功能間分區(qū)及人物流組織見(jiàn)示意圖2。

圖2 功能間分區(qū)及人物流Fig.2 Functional zoning and process flows

3.3 潔凈區(qū)的劃分

中國(guó)和歐盟潔凈區(qū)分級(jí)為：一般生產(chǎn)區(qū)，D級(jí)潔凈區(qū)（靜態(tài)ISO 8級(jí)，動(dòng)態(tài)無(wú)要求）、C級(jí)潔凈區(qū)（靜態(tài)ISO 7級(jí)，動(dòng)態(tài)ISO 8級(jí)）、B級(jí)潔凈區(qū)（靜態(tài)ISO 5級(jí)，動(dòng)態(tài)ISO 7級(jí)）、A級(jí)潔凈區(qū)（靜態(tài)ISO 5級(jí)，動(dòng)態(tài)ISO 5級(jí)）。美國(guó)FDA生物制品潔凈分區(qū)為：NC區(qū)（Unclassified）、CNC區(qū)（Controlled Not Classified）、ISO 8級(jí)區(qū)（動(dòng)態(tài)）、動(dòng)態(tài)ISO 7級(jí)區(qū)（動(dòng)態(tài)）、ISO 5級(jí)區(qū)（動(dòng)態(tài)）。按從嚴(yán)考慮的原則，根據(jù)中國(guó)GMP、歐盟GMP和美國(guó)FDA的cGMP要求綜合考慮[14]，本項(xiàng)目的潔凈區(qū)分級(jí)分為：NC區(qū)、CNC區(qū)、D級(jí)潔凈區(qū)、C級(jí)潔凈區(qū)、A級(jí)潔凈區(qū)。

3.4 人員凈化策略

結(jié)合本次項(xiàng)目實(shí)況，采用嚴(yán)格單向流布局，更衣人員單向流動(dòng)，更衣策略如下：

人員從室外NC區(qū)進(jìn)入車(chē)間，在總更區(qū)進(jìn)行更鞋、脫外衣、穿CNC工作服，經(jīng)過(guò)CNC走廊，進(jìn)入潔凈區(qū)更衣間；在潔凈區(qū)一更更鞋、洗手，二更不脫衣，直接套穿潔凈工作服，手消后進(jìn)入潔凈生產(chǎn)區(qū)，退出潔凈區(qū)時(shí)脫去潔凈工作服，保留CNC工作服退到CNC區(qū)。

3.5 物品凈化策略

為防止生產(chǎn)過(guò)程中造成交叉污染，應(yīng)設(shè)置獨(dú)立的物流進(jìn)入生產(chǎn)區(qū)域的入口，避免與人流交叉。對(duì)原輔料、設(shè)備備件、器具、衣物以及設(shè)備安裝及檢修等走向應(yīng)作合理規(guī)劃。潔凈室使用的原輔料、包裝材料和其他物品入口應(yīng)設(shè)置物料凈化用室或設(shè)施；進(jìn)入無(wú)菌潔凈室的原輔料、包裝材料和其他物品還應(yīng)在入口設(shè)置滅菌設(shè)施。

3.6 產(chǎn)品退出策略

各產(chǎn)品在潔凈區(qū)的物料傳遞手段同原輔料流向的處理手段相當(dāng)。值得注意的是，部分成品退出涉及到產(chǎn)品表面附著有生物活性物質(zhì)，直接退出可能會(huì)污染其他無(wú)生物活性物質(zhì)區(qū)域，所以產(chǎn)品退出時(shí)結(jié)合產(chǎn)品的特性具體考量，采用消毒液擦拭滅活或VHP滅活對(duì)表面的活性物質(zhì)進(jìn)行滅活。

3.7 污物退出策略

各生產(chǎn)區(qū)產(chǎn)生的帶生物活性的物品（包括廢棄污物、衣物、潔具、器具支撐桶等）經(jīng)過(guò)雙扉濕熱滅菌柜或雙扉VHP滅菌柜進(jìn)行滅活，滅活后移出生產(chǎn)區(qū)。無(wú)生物活性的污物可通過(guò)潔凈傳遞窗傳出，或者通過(guò)物流氣閘逆向退出。

4 實(shí)際案例分析

4.1 功能區(qū)劃及人物流組織

圖3為功能區(qū)劃及人、物流組織示意圖。

圖3 A車(chē)間功能區(qū)劃及人、物流組織Fig.3 Functional zoning and process flows

功能區(qū)劃：本項(xiàng)目一層為AAV原液車(chē)間，層高5.5 m，面積約為1 200 m2，車(chē)間東北角為設(shè)置為人、流入口，西北角設(shè)置為物流入口，西南角設(shè)置為污物出口，在車(chē)間整體布局上實(shí)現(xiàn)人流、物流、污物流空間上互不交叉，減少人物流的交叉污染。北面作為空調(diào)、空壓、制水、強(qiáng)電、弱電、水管井、氣瓶間、衛(wèi)生間等NC輔助區(qū)的布置；西面為發(fā)電機(jī)房、滅活間、廢棄物間等NC輔助區(qū)布置；NC區(qū)的人員均從室外進(jìn)入，無(wú)需從CNC進(jìn)入，避免工程操作人員進(jìn)機(jī)房檢修對(duì)生產(chǎn)操作區(qū)造成影響；東面為辦公總更等輔助區(qū)布置。

人員流向設(shè)計(jì)：人員從東北角的人廳進(jìn)入車(chē)間，上完衛(wèi)生間后，在辦公區(qū)域放下個(gè)人物品，通過(guò)總更衣?lián)Q上CNC工作服進(jìn)入CNC區(qū)，再通過(guò)潔凈更衣進(jìn)入潔凈輔助支持區(qū)，之后人員通過(guò)人氣閘進(jìn)入各個(gè)工藝功能間的生產(chǎn)崗位，操作完的人員通過(guò)退出氣閘退到統(tǒng)一的退出走道，再通過(guò)退更間去除身上攜帶活性物質(zhì)的潔凈服后返回CNC區(qū)，通過(guò)總更退回辦公等NC區(qū)域，人員在接觸活性物質(zhì)的工藝功能間單向流動(dòng)，通過(guò)退更手消等凈化措施后退出生產(chǎn)區(qū)，最大限度減少交叉污染。

物（原輔包材、污物）流向設(shè)計(jì)：物流從西北角電梯進(jìn)入，通過(guò)貨梯廳的氣閘進(jìn)入CNC走道，再通過(guò)物凈氣閘進(jìn)入潔凈輔助支持區(qū)，物料在各自的配液間進(jìn)行稱(chēng)量配液后，通過(guò)物氣閘進(jìn)入各個(gè)工藝功能間的生產(chǎn)崗位，操作完的廢棄物、器具、潔具、器具支撐桶等通過(guò)退出氣閘統(tǒng)一退到退出走道，再通過(guò)濕熱滅菌柜或VHP滅菌柜滅活后退到廢棄物間和清洗滅菌間，廢棄物通過(guò)傳遞窗從廢棄物間（CNC）直接傳遞到廢棄物暫存間（NC）；器具滅活后傳入清洗滅菌間，清洗滅菌后再傳入各功能間使用；衣物滅活后轉(zhuǎn)移到洗衣間，通過(guò)雙扉工衣清洗烘干機(jī)清洗后進(jìn)入整衣間，整理打包滅菌后傳到更衣間使用。

產(chǎn)品流向設(shè)計(jì)：主要功能間由東到西依次為接種、培養(yǎng)、粗存、精純，起始細(xì)胞通過(guò)傳遞窗進(jìn)入接種間，過(guò)程中的培養(yǎng)液和純化液通過(guò)傳遞窗、穿墻管道等手段，工藝物流由東到西，原液從物流入口再返回到倉(cāng)庫(kù)。

4.2 潔凈分區(qū)及壓差設(shè)計(jì)

潔凈分區(qū)：本項(xiàng)目的潔凈區(qū)分級(jí)分為：NC區(qū)、CNC區(qū)、D級(jí)潔凈區(qū)、C級(jí)潔凈區(qū)、A級(jí)潔凈區(qū)。NC區(qū)主要為生產(chǎn)區(qū)之外的功能間，包括輔助機(jī)房、辦公、衛(wèi)生間以及室外相關(guān)的部分，NC區(qū)不作管控；CNC區(qū)為生產(chǎn)車(chē)間的輔助區(qū)域，人員需要通過(guò)總更進(jìn)入，物品需要經(jīng)過(guò)外清脫包進(jìn)入，CNC區(qū)作人物流、粉塵粒子、溫濕度管控；D級(jí)區(qū)主要作為CNC區(qū)與C級(jí)區(qū)的人物凈化過(guò)渡，本項(xiàng)目不存在實(shí)際的D級(jí)功能間；C級(jí)區(qū)為主要的操作功能間，涉及原輔料暴露操作的功能間以及配套的走道及配套功能間；A級(jí)區(qū)（靜態(tài)）主要為活性物質(zhì)直接暴露的區(qū)域以及粉塵暴露對(duì)人員有危害的區(qū)域，本項(xiàng)目主要為生物安全柜和負(fù)壓稱(chēng)量罩。具體見(jiàn)表3和圖4。

表3 功能間潔凈分區(qū)表Tab.3 Clean zoning of function room

壓差設(shè)計(jì)：壓差的合理設(shè)置能有效保證產(chǎn)品不被污染，同時(shí)也需要兼顧生物安全活性物質(zhì)不泄漏到環(huán)境，對(duì)外界造成影響，設(shè)計(jì)的基本原則為NC區(qū)不控制壓差，CNC區(qū)基準(zhǔn)壓差按+5 Pa控制，有污染區(qū)域?yàn)樨?fù)壓；D級(jí)區(qū)按17.5 Pa設(shè)置，比CNC高12.5 Pa，在實(shí)際運(yùn)行中考慮到±2.5 Pa波動(dòng)，能有效保證D級(jí)區(qū)比CNC高10 Pa的有效控制；C級(jí)區(qū)按30 Pa的基準(zhǔn)進(jìn)行設(shè)置，保證比D級(jí)大于10 Pa，同時(shí)考慮±2.5 Pa波動(dòng)，C級(jí)區(qū)內(nèi)不同功能間的壓差設(shè)置按5 Pa的壓差考慮，主要功能間通過(guò)進(jìn)入氣閘與退出氣閘分別與進(jìn)入走道和退出走道相連，進(jìn)入氣閘設(shè)置為正壓氣泡型氣閘，退出氣閘設(shè)置為負(fù)壓陷阱型氣閘，有生物安全活性物質(zhì)直接暴露的功能間相對(duì)于相鄰的有開(kāi)門(mén)的功能間形成相對(duì)負(fù)壓，防止有生物安全活性物質(zhì)泄漏。平面壓差布置詳見(jiàn)圖4。

圖4 車(chē)間潔凈分區(qū)及壓差布置Fig.4 Clean partition and differential pressure layout of workshop

4.3 生物安全防護(hù)設(shè)計(jì)

本項(xiàng)目使用到的生物安全活性物質(zhì)主要有293細(xì)胞（BSL-2）、質(zhì)粒（BSL-1）、AAV病毒（BSL-2）。當(dāng)一個(gè)房間存在兩種以上的物質(zhì)時(shí)，生物安全按高級(jí)別實(shí)行，各主要功能間存在的活性物質(zhì)如表4所 示。

表4 功能間生物安全定級(jí)表Tab.4 Biosafety classification of function room

主要功能間直接接觸生物活性物質(zhì)，全部定義為P2防護(hù)等級(jí)，與主要功能間直接相連的人氣閘、物氣閘、退出氣閘、退出走道、滅活間、傳遞窗、濕熱滅活柜、VHP滅活柜等間接接觸活性物質(zhì)的空間，從嚴(yán)要求也全部定義為P2防護(hù)等級(jí)。P2防護(hù)區(qū)對(duì)周邊區(qū)域形成相對(duì)負(fù)壓，空調(diào)為直排風(fēng)型，排風(fēng)上屋面經(jīng)過(guò)高效過(guò)濾后高空排放；活性廢水通過(guò)專(zhuān)用管道進(jìn)入滅活罐收集后通過(guò)高溫滅活后再進(jìn)行污水處理；人員通過(guò)專(zhuān)用的人員正壓氣閘穿上防護(hù)服后進(jìn)入，通過(guò)統(tǒng)一的退出走道和退更氣閘退出，退出時(shí)人員進(jìn)行退更和手消毒，物品經(jīng)過(guò)專(zhuān)用的物品正壓氣閘進(jìn)入，廢棄物、衣物、潔具、器具支撐桶等通過(guò)雙扉濕熱滅菌柜或雙扉VHP滅菌柜滅活后退出到廢棄物間和清洗間，原液和樣品用消毒液表面消殺后通過(guò)傳遞窗傳出，有效保證生物活性物質(zhì)不外泄。防護(hù)區(qū)30 m范圍內(nèi)均設(shè)置緊急淋浴裝置。具體區(qū)域劃分見(jiàn)圖5。

圖5 車(chē)間生物安全分區(qū)Fig.5 Biosafety zoning of workshop

5 結(jié)束語(yǔ)

本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外法規(guī)，從工藝流程、功能區(qū)劃、人物流組織、生物安全等方面對(duì)基因治療藥物生產(chǎn)車(chē)間進(jìn)行分析，但目前國(guó)內(nèi)尚未有商業(yè)化的基因治療藥物產(chǎn)品上市，正式的指導(dǎo)性法規(guī)也尚未頒布，在車(chē)間的設(shè)計(jì)中，尚存在一定的不確定性，所以在設(shè)計(jì)中，應(yīng)該更加嚴(yán)格地考慮GMP原則以及生物安全的防護(hù)要求，使得建成的車(chē)間可以適用于未來(lái)的法規(guī)要求。