程向東 ，陳海波 ，張艷波 ，孫永超，劉征

(1.黑龍江省林科院伊春分院， 黑龍江 伊春 153099；2.伊春市豐林縣林業(yè)調(diào)查設(shè)計質(zhì)檢隊， 黑龍江 伊春 153036 )

篤斯越桔(vacciniumuliginosumLinn.)又稱篤斯,杜鵑花科(Ericaceae),越桔屬(vacciniumL.)落葉灌木,極耐寒，集中分布在我國大興嶺、小興安嶺及長白山地區(qū)，生長在海拔400～1000 m的林間空地，和闊葉、針葉林混交林中，與篤斯越桔混生的植物有：油樺、紅果越桔、杜香、泥炭蘚、蔓越桔、落葉松等，其果實(shí)營養(yǎng)價值極高，富含抗氧化劑、花色素苷、類黃酮等化合物以及豐富的微量元素，這些化合物與清除和抑制人體自由基以及逆轉(zhuǎn)人體衰老有密切關(guān)系，是我國最重要的野生資源之一，近年來由于過度采集,缺乏保護(hù)措施,篤斯越桔資源正在急劇減少,野生資源的破壞非常嚴(yán)重, 現(xiàn)有的篤斯越桔野生資源已遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場的需求,很有必要進(jìn)行人工馴化栽培。在篤斯越桔馴化栽培過程中,發(fā)現(xiàn)篤斯越桔種子育苗困難，因此，對篤斯越桔進(jìn)行組培試驗(yàn)研究，初步掌握了篤斯越桔組培育苗的方法，為篤斯越桔遺傳改良和篩選優(yōu)良無性系打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2016年5月下旬取自伊春紅星林業(yè)局清水河林場經(jīng)過選優(yōu)的野生篤斯越桔。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體材料的處理。選取篤斯越桔生長狀態(tài)健壯枝條,剪取長約1 ～1.5 cm莖尖,用自來水流水沖洗,在超凈工作臺上先用75%酒精涮洗20 s,用0.1%氯化束溶液表面滅菌,滅菌時間分別為2 min,滅菌后用無菌水沖洗3次,并于無菌水中浸泡40～60 min后取出用無菌濾紙吸干材料表面多余水分,切除被殺菌消毒劑損傷部分后作為外植體備用。

1.2.2 誘導(dǎo)頂芽萌發(fā)。以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基進(jìn)行改良，具體改良方法:用MgSO4、煙酸代替原WPM培養(yǎng)基中的MgSO4。7H2O、VB5，用玉米素0.7 mL/L作為生長激素，瓊脂7g/L、糖25 g/L，光照為12 h/d條件下培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為1500 lx)，溫度條件為18 ℃,。剪去莖尖末端多余部分后,在無菌條件下將莖尖段接種于改良WPM培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)莖尖萌發(fā)，接種30瓶，每瓶接種3株。

1.2.3 叢生芽的誘導(dǎo)與増殖。外植體在改良后的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，待莖段頂芽伸長展葉后，在無菌條件下將莖段分別轉(zhuǎn)接于WPM培養(yǎng)基和改良的培養(yǎng)基上，光照為15 h/d條件下培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為2000 lx)，溫度條件為20 ℃, 每個處理3次重復(fù), 每個重復(fù)接種10瓶, 調(diào)查苗高、苗數(shù)、分支數(shù)。

1.2.4 繼代培養(yǎng)。通過誘導(dǎo)后獲得的叢生芽苗培養(yǎng)一段時間后,為了防止培養(yǎng)物老化或培養(yǎng)基養(yǎng)分利用完而造成營養(yǎng)不良及代謝物過多積累產(chǎn)生毒害等影響,要及時將其接種到新的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng),以便培養(yǎng)物能夠順利地增殖生長及分化,長成完整的植株。改良的WPM培養(yǎng)基中KH2PO4從17 g/L減至8.5 g/L, 玉米素減至0.5 mL/L作為生長激素，調(diào)整后作為繼代培養(yǎng)基，光照為16 h/d條件下培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為2500 lx)，溫度條件為25 ℃。進(jìn)行3次繼代培養(yǎng)，每次培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計苗高、莖粗、分化數(shù)等指標(biāo)。

1.2.5 生根培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)后，剪取苗高約2 cm左右的不定芽,分別轉(zhuǎn)接于以改良的1/2WPM、1/3 WPM、1/4 WPM為培養(yǎng)基, 培養(yǎng)基中瓊脂7 g/L、糖減至15 g/L，溫度為22 ℃，光照為12 h/d條件下培養(yǎng)(光照強(qiáng)度為1500 lx)。每種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接30瓶，調(diào)查生根情況。

1.2.6 生長調(diào)查。測量生根率、苗高、徑粗、分枝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)頂芽萌發(fā)

試驗(yàn)結(jié)果表明, 莖尖在啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)l5 d時開始萌動，葉片展開伸長,經(jīng)20 d培養(yǎng),苗高可達(dá)2 cm左右。在接種4d后逐漸出現(xiàn)接種材料污染，7～15 d內(nèi)出現(xiàn)的污染瓶數(shù)最多，達(dá)到8瓶,15～20 d出現(xiàn)4瓶污染。20 d后沒有污染出現(xiàn)。可見篤斯越桔的外植體與培養(yǎng)基上殘留的微生物中，細(xì)菌與真菌生長緩慢，需要20 d左右才能出現(xiàn)污染現(xiàn)象，在鑒定外植體誘導(dǎo)頂芽是否成功時，一般20 d后沒有污染，頂芽啟動，開始有新芽或新葉生長，才算基本成功。在這期間要注意觀察，及時清除污染材料。采用莖尖作為誘導(dǎo)材料時，易出現(xiàn)誘導(dǎo)材料褐變，這時就要減少光照、在制備培養(yǎng)基時加入抗氧化劑或活性炭、最后要及時跟換培養(yǎng)基。

2.2 叢生芽的誘導(dǎo)與増殖

試驗(yàn)結(jié)果表明,通過啟動培養(yǎng)基獲得的無菌材料，轉(zhuǎn)接到WPM培養(yǎng)基和改良的培養(yǎng)基上，改良的培養(yǎng)基10 d培養(yǎng)材料就開始萌動，20 d左右形成叢生芽，WPM基本培養(yǎng)基13 d才萌動，25 d左右形成叢生芽，轉(zhuǎn)接的60瓶中，7 d內(nèi)有5瓶污染，7～20 d有3瓶污染，35 d后統(tǒng)計苗高、莖粗、分化枝條數(shù)等指標(biāo)，表1。

表1 不同培養(yǎng)基幼苗生長調(diào)查表

從表1看出，WPM基本培養(yǎng)基中的平均苗高為3.6 cm,平均莖粗為0.07 cm，平均分枝數(shù)為4個。改良WPM培養(yǎng)基中的平均苗高為4.1 cm,平均莖粗為0.08 cm，平均分枝數(shù)為5個。經(jīng)方差分析苗高的F值為21.93差異顯著，莖粗的F值為10.69差異顯著，分枝數(shù)的F值為9.78差異顯著，可見改良WPM培養(yǎng)基中的幼苗長勢優(yōu)于WPM基本培養(yǎng)基。

2.3 繼代培養(yǎng)

試驗(yàn)結(jié)果表明,每次繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)材料7 d后就開始萌動，18 d左右就形成叢生芽，幼苗生長30 d開始下一次繼代培養(yǎng)，幼苗長勢較快，污染率明顯降低。每次繼代培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計苗高、莖粗、分化枝條數(shù)等指標(biāo)，見表2。

表2 繼代培養(yǎng)幼苗生長調(diào)查表

從表2看出，每次繼代培養(yǎng)的幼苗在平均苗高、平均分支數(shù)都優(yōu)于對照，但莖粗的長勢不如對照，經(jīng)方差分析苗高的F值為0.018差異不顯著，莖粗的F值為10.58差異及顯著，分枝數(shù)的F值為4.12差異顯著，對莖粗及分支數(shù)進(jìn)行多重比較，見表3。

表3 莖粗及分支數(shù)多重比較

從表3看出，平均莖粗的多重比較結(jié)果是，1代繼代培養(yǎng)幼苗與對照差異不顯著，1代繼代培養(yǎng)幼苗與2代繼代培養(yǎng)幼苗、3代繼代培養(yǎng)幼苗差異顯著，2代繼代培養(yǎng)幼苗與3代繼代培養(yǎng)幼苗差異不顯著，幼苗的莖粗從對照到3次繼代培養(yǎng)，有逐漸變細(xì)的趨勢，這種變化與培養(yǎng)基的調(diào)整無關(guān)，幼苗的莖粗隨著繼代次數(shù)增加，不斷變細(xì)。平均分枝數(shù)的多重比較結(jié)果是，3次繼代培養(yǎng)培養(yǎng)的幼苗與對照差異顯著，而3次繼代培養(yǎng)培養(yǎng)的幼苗之間差異不顯著，3次繼代培養(yǎng)培養(yǎng)的幼苗分枝數(shù)都高于對照，表明與培養(yǎng)基調(diào)整有關(guān)。

2.4 生根培養(yǎng)

2.4.1 瓶內(nèi)生根培養(yǎng)。將繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d的幼苗，篩選健壯生長良好的幼苗剪成2 cm,分別移入改良的1/2WPM、1/3 WPM、1/4 WPM為基本培養(yǎng)基。45 d后調(diào)查生根情況，三種處理只生成塊狀愈傷組織，沒有獲得瓶內(nèi)生根的幼苗。

2.4.2 瓶外生根培養(yǎng)。芽苗經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)，在繼代培養(yǎng)基上生長35 d，苗高達(dá)3.5～4.5 cm時，可以進(jìn)行瓶外生根培養(yǎng)，把組培苗剪成長度2 cm，保留兩個葉片，沾濃度為150 ppm1號生根粉15秒，扦插在泥炭蘚上，定期澆水，溫度保持22 ℃，55～60 d后，扦插苗陸續(xù)生根，幼苗開始生長，但生根率很低，只有23.3%。

3 結(jié)論與討論

采用篤斯越桔的莖尖作為外植體時，要防止誘導(dǎo)材料褐變，這時就要減少光照、在制備培養(yǎng)基時加入抗氧化劑或活性炭、最后要及時跟換培養(yǎng)基。

誘導(dǎo)篤斯越桔在進(jìn)行啟動培養(yǎng)時，生長激素玉米素濃度可以高一些達(dá)到0.7 mL/L，在繼代培養(yǎng)時降至0.5 mL/L。

篤斯越桔組培苗在繼代培養(yǎng)的過程中，隨著繼代次數(shù)的增加幼苗的莖粗有變細(xì)的趨勢，繼代2次以后幼苗莖粗在0.06 cm左右，這造成篤斯越桔組培苗瓶外生根培養(yǎng)操作，以及瓶內(nèi)生根培養(yǎng)后的練苗操作困難，只能在實(shí)驗(yàn)室少量進(jìn)行育苗，不能在實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模育苗。

篤斯越桔組培苗可以瓶外生根培養(yǎng)，但插穗纖細(xì)不易操作，生根率不高。