梁傳成，李麗妍，王麗文，邵然

(1.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,沈陽 110034；2.黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,鄭州 450063)

21世紀(jì)初,除草劑是農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)中增長最快的部分.它在世界上的廣泛使用導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染，并通過食物鏈影響人類健康[1-2].作為水生生態(tài)系統(tǒng)中最重要的生物類群之一，兩棲動(dòng)物因?qū)λh(huán)境變化的敏感性而對(duì)水體污染具有一定的響應(yīng)能力.水體的化學(xué)污染是近年來備受全球關(guān)注的兩棲動(dòng)物種群數(shù)量減少和一些物種滅絕的主要因素[3].

丁草胺，即2,6-二乙基-N-(丁氧甲基)-氯乙酰替苯胺，是一種酰胺類除草劑，因其高效、低毒、價(jià)格低廉，成為我國稻田除草劑中用量最大的一種[4].然而，其疏水性強(qiáng)、易吸附、淋溶性低、對(duì)非靶生物的毒性作用已引起廣泛關(guān)注[5].丁草胺毒性研究主要涉及除草劑對(duì)兩棲動(dòng)物的形態(tài)、遺傳毒性和生物積累等方面[6-8]，而關(guān)于丁草胺對(duì)兩棲類動(dòng)物的生理生化毒性，特別是抗氧化防御系統(tǒng)方面的報(bào)道較少.本文以環(huán)境指示動(dòng)物中華大蟾蜍(Bufobufogargarigans)為研究對(duì)象，通過評(píng)價(jià)藥物作用后蟾蜍腦肝組織蛋白質(zhì)量濃度、氧化應(yīng)激指標(biāo)和神經(jīng)組織學(xué)變化來揭示丁草胺的腦和肝臟毒性，為除草劑的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

丁草胺(2,6-二乙基-N-(丁氧甲基)-氯乙酰替苯胺，C17H26ClNO2，有效成分體積分?jǐn)?shù)60%，乳油)購自大連孟山都公司.健康成年中華大蟾蜍120只，購自沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心.雌雄隨機(jī)，體質(zhì)量(37.8±6.9) g，隨機(jī)分為4組.根據(jù)丁草胺在稻田中施用的質(zhì)量濃度設(shè)定染毒劑量，丁草胺質(zhì)量濃度為3，15，30 mg/L，分別為其稻田施用質(zhì)量濃度的1，5，10倍.試驗(yàn)組分別放入盛有充分曝氣的清水和丁草胺溶液的桶內(nèi)(20 cm×30 cm，1個(gè)實(shí)驗(yàn)桶內(nèi)5只蟾蜍).溶液的量為浸沒1/2蟾蜍體積.每24 h更換試驗(yàn)用液一次以保證藥液濃度和水中溶解氧質(zhì)量濃度.染毒期間室溫(20～25 ℃)，自然光照，禁食.連續(xù)染毒3，6，9 d后，每組分別取10只蟾蜍，毀髓后采集蟾蜍大腦、肝臟樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2 理化指標(biāo)檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析

Bradford法測(cè)定腦和肝的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度[9].采用光化學(xué)硝酸藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性[10].根據(jù)文獻(xiàn)[11]測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性.丙二醛(MDA)作為脂質(zhì)過氧化(LPO)的標(biāo)記物，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[12].制備蟾蜍腦組織常規(guī)石蠟切片，尼氏染色，樹膠封片后觀察.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計(jì)分析.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異性采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，組間差異的多重比較采用 Tukey 檢驗(yàn)，P<0.05為顯著差異.

2 結(jié) 果

2.1 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度

腦和肝臟蛋白質(zhì)量濃度的變化分別見圖1.由圖可知，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組腦蛋白質(zhì)量濃度均下降，3 mg/L和15 mg/L組僅在染毒6 d與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，而30 mg/L組，各染毒時(shí)間腦蛋白質(zhì)量濃度均與對(duì)照組呈顯著性差異(P<0.05), 但不呈時(shí)間依賴性.不同于腦蛋白，肝蛋白隨染毒時(shí)間的延長，其質(zhì)量濃度均增高(除3 mg/L，3 d組).3 mg/L和30 mg/L組在染毒6 d與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，而15 mg/L組在染毒9 d與對(duì)照組差異顯著(P<0.05).

2.2 酶活性和MDA測(cè)定

丁草胺誘導(dǎo)的蟾蜍腦內(nèi)和肝臟的SOD和MDA質(zhì)量濃度，CAT活性變化分別見圖2.隨丁草胺暴露時(shí)間的延長和劑量增加，誘導(dǎo)腦內(nèi)SOD活性先升高而后迅速下降.3 mg/L和15 mg/L組SOD在染毒6 d活性顯著降低，9 d升高.30 mg/L組在染毒3 d SOD活性略有升高，隨后顯著降低.3 mg/L組和15 mg/L組的肝臟SOD活性隨染毒時(shí)間延長略有上升，30 mg/L組肝臟SOD活性在染毒3 d時(shí)顯著下降，后經(jīng)升高后再次顯著下降.

腦部和肝臟CAT活性雖然經(jīng)丁草胺誘導(dǎo)均低于對(duì)照組，但趨勢(shì)相反，腦部CAT活性隨著染毒時(shí)間延長呈上升趨勢(shì)，而肝臟CAT活性隨染毒時(shí)間延長而逐漸降低(除3 mg/L，3 d組).肝臟內(nèi)，在3 mg/L組3 d CAT活性誘導(dǎo)升高，后隨著染毒時(shí)間延長逐漸抑制(P>0.05).而在15 mg/L和30 mg/L組，CAT活性均被抑制且呈顯著性差異.

脂質(zhì)過氧化水平以丙二醛(MDA)質(zhì)量濃度來表示.腦和肝臟中MDA質(zhì)量濃度均在丁草胺誘導(dǎo)下增加，均呈劑量-時(shí)間依賴性，且腦中MDA質(zhì)量濃度變化比肝臟中更為顯著.

2.3 組織學(xué)結(jié)果

丁草胺誘導(dǎo)的蟾蜍端腦海馬區(qū)組織學(xué)變化見圖3.由圖可見，暴露低濃度丁草胺中的海馬區(qū)細(xì)胞核增大.隨著丁草胺濃度的增加，海馬區(qū)細(xì)胞逐漸溶解，組織間隙增大，出現(xiàn)空泡化.30 mg/L組海馬區(qū)側(cè)腦室管周膜及周圍細(xì)胞溶解最為顯著，空泡面積加大，使側(cè)腦室界限模糊.

3 討 論

蛋白質(zhì)是生理活動(dòng)的載體和執(zhí)行者，其正常功能會(huì)因外源污染物入侵而發(fā)生直接或間接的改變[13].酰胺類除草劑經(jīng)雜草的胚芽和根部吸收運(yùn)輸至植株各部位，通過抑制植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成而導(dǎo)致雜草死亡.本研究中，腦蛋白質(zhì)量濃度隨丁草胺濃度和暴露時(shí)間延長而先升后降，3 mg/L組和15 mg/L組與對(duì)照組相比在丁草胺暴露6 d有顯著性差異(P<0.05).但同肝臟蛋白質(zhì)量濃度變化情況比較而言，腦部蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度雖有下降，但下降幅度遠(yuǎn)不及肝臟部位，這可能是由于血腦屏障的保護(hù)作用，丁草胺在短時(shí)間內(nèi)難以大量透過血腦屏障.染毒9 d出現(xiàn)了蛋白質(zhì)水平回升現(xiàn)象，可能是由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)丁草胺染毒的應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白水平升高所致，也可能與除草劑在蟾蜍體內(nèi)的持續(xù)積累有關(guān).組織學(xué)結(jié)果顯示端腦海馬區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，以6 d最為明顯，而腦蛋白在6 d蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最少，由此可從組織學(xué)角度印證藥物對(duì)腦蛋白質(zhì)量濃度的影響.丁草胺暴露后肝臟蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度逐漸升高，這與肝臟的功能有關(guān).肝臟是一種重要的代謝器官，可代謝和分解來自機(jī)體產(chǎn)生的有害廢物及體外的毒物、藥物和毒素等.

本研究表明丁草胺對(duì)蟾蜍肝臟蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的影響具有劑量和時(shí)間依賴性，這可能與蟾蜍對(duì)藥物的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān).當(dāng)機(jī)體促氧化劑和抗氧化劑比例失衡時(shí)，即產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧(ROS)的產(chǎn)生.細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶如SOD和CAT是生物體中負(fù)責(zé)清除ROS和保護(hù)細(xì)胞的重要抗氧化酶.SOD活性水平可以間接反映ROS水平和細(xì)胞損傷程度.隨環(huán)境污染加劇，SOD活性會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制的應(yīng)激性變化.這些變化是僅是生物體的一種暫時(shí)狀態(tài)而非最終的毒理學(xué)影響.這兩種狀態(tài)的出現(xiàn)取決于毒物暴露的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，當(dāng)然也取決于物種的敏感性.與對(duì)照組相比，丁草胺3 mg/L和15 mg/L組蟾蜍肝臟中SOD活性在3 d后顯著升高，而30 mg/L組蟾蜍肝臟中SOD活性顯著降低，僅在第6 d出現(xiàn)應(yīng)激性升高，后下降.上述結(jié)果表明，低劑量除草劑對(duì)抗氧化酶的產(chǎn)生有一定的刺激作用，而高劑量除草劑對(duì)抗氧化酶的產(chǎn)生有一定的抑制作用，高濃度組直接破壞了抗氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制.該結(jié)果與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的中高濃度阿維菌素抑制鯉魚肝細(xì)胞中SOD活性相似.

在誘導(dǎo)SOD清除細(xì)胞間超氧陰離子自由基的過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的H2O2，作為細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)關(guān)鍵酶之一的過氧化氫酶(CAT)能促進(jìn)H2O2分解，保護(hù)細(xì)胞免受H2O2的氧化損傷，并減少自由基的形成和脂質(zhì)過氧化.CAT活性可以被污染脅迫所改變.本研究表明，蟾蜍腦內(nèi)CAT活性受到了明顯的抑制，這可能與丁草胺使CAT與H2O2相互作用使酶活性降低有關(guān).而肝臟在低劑量暴露時(shí)，CAT活性受到誘導(dǎo)顯著升高，與肝臟中SOD活性的變化相對(duì)應(yīng).而隨著染毒時(shí)間和濃度的增加，CAT活性呈時(shí)間-劑量依賴性抑制，大劑量和較長時(shí)間的藥物處理，均超過了SOD和CAT的清除能力范圍.

H2O2或超氧化物等強(qiáng)氧化劑使不飽和脂肪酸經(jīng)非酶性氧化的過程被稱為脂質(zhì)過氧化.MDA即為脂質(zhì)過氧化的典型產(chǎn)物之一，是由氧自由基攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸而引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用中形成的，可以間接反映細(xì)胞損傷的程度.本研究結(jié)果表明，MDA水平隨著丁草胺劑量的增加而顯著升高，并呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系.提示藥物作用使活性氧自由基水平增加，脂質(zhì)過氧化逐漸增強(qiáng)，MDA積累增多.這與他人在魚類中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似[15].