仉華，申聰聰，陳粵華，樊思敏

(河南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

葡萄糖作為生物體內(nèi)能量的主要來源，對維持生命健康至關(guān)重要.近年來，糖尿病的發(fā)病率持續(xù)增加，作為一種常見的致死性慢性疾病可能引發(fā)尿毒癥、高血壓、心血管及并發(fā)癥，嚴重影響患者的生命健康[1-3].血液中的葡萄糖含量即血糖，成為糖尿病檢測的重要靶標，開發(fā)一種簡單、快速、準確的葡萄糖檢測方法有利于實現(xiàn)糖尿病的早期診斷.目前已報道的葡萄糖分析方法有比色法、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法、電化學(xué)發(fā)光法等[1-2,4-6]，其中電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(Electrochemiluminescence，ECL)集電化學(xué)傳感和化學(xué)發(fā)光為一體，兼具高靈敏度、操作簡單、響應(yīng)時間快、成本低等優(yōu)點，在臨床檢驗診斷、食品安全檢測和環(huán)境污染監(jiān)測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.傳統(tǒng)的電化學(xué)酶傳感器是通過天然的葡萄糖氧化酶特異性,高效地催化氧化D-葡萄糖為D-葡萄糖酸內(nèi)酯和H2O2，直接進行電化學(xué)檢測或通過引入氧化還原介質(zhì)進一步催化H2O2氧化生成活性氧級聯(lián)放大電化學(xué)發(fā)光信號強度,從而實現(xiàn)對葡萄糖的高選擇性、高靈敏度檢測，使其成為葡萄糖酶傳感器研究最廣泛的生物酶之一[7-9].文獻[10]將葡萄糖氧化酶和葡萄糖在溶液中混合直接產(chǎn)生H2O2增強魯米諾的ECL性能,同時測定H2O2，葡萄糖及葡萄糖氧化酶的活性.該方法操作簡單，應(yīng)用廣泛，然而生成的H2O2與電極反應(yīng)界面距離遠、易分解,限制了檢測靈敏度的提高.通過引入載體固定生物酶不僅可以提高酶的負載效率，而且還能縮短酶催化反應(yīng)在電極表面的電子傳遞距離.文獻[11]合成具有ECL特性的CdS量子點負載葡萄糖氧化酶，使得H2O2在電極表面原位生成，有效增強了CdS的發(fā)光效率，但CdS的生物毒性限制了該方法在生物檢測方面應(yīng)用，同時生物酶需要適當?shù)墓潭ɑ侄蝸肀ＷC其高效的催化活性.隨著納米材料的進一步研究，科研工作者通過開發(fā)一系列納米模擬酶催化葡萄糖分解來檢測葡萄糖含量，如文獻[12]設(shè)計合成了3D Cu-Flo.@AuNPs復(fù)合納米材料構(gòu)建無酶葡萄糖ECL傳感器，該方法無須考慮酶活性因素,拓寬了測試條件，然而小顆粒的納米材料易團聚制約了其催化的穩(wěn)定性.因此，鑒于生物酶良好的催化活性和優(yōu)異的選擇性，設(shè)計高效、生物安全性好的酶固定化手段能夠顯著提高實際樣品中葡萄糖的測定效率.

立方體結(jié)構(gòu)的普魯士藍(Prussian Blue，PB)是由鐵和亞鐵氰化物組成的金屬有機框架材料，能夠作為氧化還原介質(zhì)高效催化H2O2，被稱為“人工過氧化物酶”，在光物理、生物醫(yī)學(xué)和電化學(xué)等領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用.由于其具有良好的生物相容性于2010年被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準為鉈的解毒劑[5,13].已有基于PB的過氧化物酶特性構(gòu)建電化學(xué)葡萄糖酶傳感器用于臨床和環(huán)境分析的報道[14].為提高催化效率，常引入導(dǎo)電性好的碳納米材料作為載體將PB固定在電極表面，如用PB納米顆粒填充碳納米管，在微碳纖維上垂直排列普魯士藍/碳納米管復(fù)合物作為超靈敏檢測葡萄糖的生物載體[15-18].以上方法雖然提高了葡萄糖的檢測靈敏度，因其需要載體、氧化還原介質(zhì)和GOx,構(gòu)建過程相對復(fù)雜.已有文獻報道HMPB納米顆粒由于空隙多、比表面積大、生物相容性好等優(yōu)勢被用作腫瘤治療劑的納米載體，具有良好的載藥量和治療性能[13,19-21].HMPB優(yōu)越的載體及過氧化物酶性質(zhì)為設(shè)計雙功能HMPB@GOx納米復(fù)合材料，構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器提供了思路.

本文通過模板法制備出80 nm左右的立方體PB納米顆粒，控制鹽酸刻蝕時間調(diào)控合成HMPB的中心空腔大小，并以此作為GOx的載體及H2O2氧化還原介質(zhì)，以魯米諾-H2O2電化學(xué)發(fā)光體系為基礎(chǔ)構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光酶傳感器級聯(lián)放大電信號超靈敏檢測葡萄糖.為了進一步增強電極的導(dǎo)電性及HMPB@GOx在電極表面的負載效率，本文通過電沉積技術(shù)將帶正電的導(dǎo)電聚合物聚苯胺(PAA)鍍在電極表面上一層，通過靜電作用將HMPB@GOx修飾在電極表面構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光葡萄糖傳感器.測試結(jié)果表明，基于HMPB@GOx構(gòu)建的ECL傳感體系在其他電活性物質(zhì)如抗壞血酸(AA),多巴胺(DA)和尿酸(UA)共存時仍對葡萄糖具有良好的選擇性，高的靈敏度和低的檢出限，進一步實現(xiàn)了實際血清中葡萄糖含量的測定.因此，該HMPB@GOx電化學(xué)發(fā)光傳感體系具有成為糖尿病患者血清中葡萄糖便攜檢測器件的潛力.

1 實驗部分

1.1 材料制備

1.1.1PB及HMPB納米顆粒的合成

PB的合成：稱取6.0 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和220 mg鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])，加入到80 mL，0.010 mol/L的鹽酸中混合攪勻，并在室溫下攪拌0.5 h得到黃色的溶液.然后將混合溶液放入聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，在烘箱中80 ℃反應(yīng) 24 h，自然冷卻至室溫.最后用一定量丙酮、二次水多次離心、洗滌，得到藍色的PB納米顆粒.

中空介孔普魯士藍(HMPB)的合成：在60 mL 1.0 mol/L 的HCl中加入300 mg 的PVP和60 mg 的PB納米顆粒，將混合液密封在聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，140 ℃反應(yīng)4 h.然后用水和乙醇多次離心、洗滌沉淀物，于真空干燥箱中過夜干燥，得到了HMPB.為驗證空心程度對GOx負載效率及ECL信號強度的影響，本文控制刻蝕時間為0，1.0，2.0,4.5和8.0 h作為對照合成材料.

1.1.2HMPB@GOx的合成

將10 mg的GOx和1.0 mg的HMPB溶解在0.5 mL的PBS中，在4 ℃條件下震蕩過夜.用二次水離心、洗滌多次以除去多余的GOx，重新分散在0.5 mL二次水中，制得HMPB@GOx復(fù)合物于4 ℃冰箱中備用.

1.2 材料表征

用日立SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)對PB的微觀表面形貌進行表征；通過JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡(TEM)觀察HMPB材料內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)；利用Zeta電位及阻抗表征HMPB@GOx的復(fù)合材料及ECL傳感體系的構(gòu)建過程.

1.3 ECL傳感器構(gòu)建及電化學(xué)測試條件優(yōu)化

1.3.1ECL傳感器的構(gòu)建

利用上海辰華電化學(xué)工作站CHI760E，在室溫下采用標準的三電極體系(直徑為3 mm的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑柱為對電極)，在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中進行電化學(xué)性能測定.

將用α-Al2O3打磨好玻碳電極浸入25 mmol/L的苯胺溶液(用0.5 mol/L H2SO4稀釋)，在-0.2～1.0 V的電壓范圍內(nèi)掃描5圈，在電極表面制備出聚苯胺(PAA)導(dǎo)電薄膜.移液槍吸取7.5 μL上述制備好的HMPB@GOx復(fù)合納米材料滴加在玻碳電極表面，室溫下干燥備用.

1.3.2條件優(yōu)化

電極表面PAA量的優(yōu)化：將打磨干凈的工作、參比和對電極浸沒在苯胺溶液中，通過控制掃描圈數(shù)分別為1,2,5,10,15,30調(diào)控電極表面PAA的量.將電聚合PAA后的玻碳電極浸入含有50 μmol/L魯米諾和6.7 μmol/L葡萄糖溶液中,設(shè)置光電倍增管高壓為600 V,測定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度.

pH優(yōu)化：配置pH分別為5.3,6.3,7.0,8.0,8.3,9.0的PBS緩沖液(5 mmol/L磷酸二氫鈉,5 mmol/L磷酸氫二鈉和100 mmol/L氯化鈉),用于魯米諾(0.01 mol/L)的稀釋.將HMPB@GOx修飾好的電極置于含有50 μmol/L魯米諾和6.7 μmol/L葡萄糖溶液中,設(shè)置光電倍增管高壓,測定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度.

魯米諾濃度優(yōu)化：用PBS(pH 8.3)將魯米諾分別稀釋成10,25,40,50,75和100 μmol/L.將HMPB@GOx修飾好的電極置于魯米諾和6.7 μmol/L葡萄糖溶液中,設(shè)置光電倍增管高壓,測定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度.

GOx濃度優(yōu)化：將1.0 mg的HMPB和1.0,5.0,10.0,15.0,20.0,30.0 mg的GOx溶解在1.0 mL的PBS中,按照以上步驟合成不同GOx負載量的HMPB@GOx復(fù)合物并修飾于電極表面.將修飾好的電極置于含有50 μmol/L魯米諾和6.7 μmol/L葡萄糖溶液中，設(shè)置光電倍增管高壓，測定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度.

PB刻蝕時間優(yōu)化：將不同刻蝕時間的HMPB按照以上方法與GOx混合形成HMPB@GOx復(fù)合物并修飾于電極表面，設(shè)置光電倍增管高壓，測定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度.

1.4 葡萄糖測定

按照以上最優(yōu)條件，將HMPB@GOx復(fù)合物修飾好玻碳電極浸入含有不同濃度葡萄糖(依次為0，3.3×10-2，3.3×10-1，1.7，3.3，6.7，16.6，50.0，100.0和167.0 μmol/L)的魯米諾溶液中,設(shè)置光電倍增管高壓為600 V，測定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度.

1.5 選擇性測定

按照以上最優(yōu)條件，將HMPB@GOx復(fù)合物修飾好玻碳電極浸入pH 8.3的魯米諾溶液中，連續(xù)滴加6.7 μmol/L的葡萄糖，抗壞血酸、尿酸或多巴胺，設(shè)置光電倍增管高壓為600 V，測定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度.

1.6 實際樣品測定

從新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院取得全血3份，在4 ℃條件下3 000 r/min 離心15 min，取得上層淡黃色血清，分別將血清10倍，100倍，1 000倍，5 000倍和10 000倍稀釋，用本方案構(gòu)建的ECL傳感器測定其葡萄糖含量.選取1 000倍稀釋的血清為實際樣品，用本方法構(gòu)建的ECL傳感器測定其葡萄糖含量并與血糖儀測定結(jié)果做對比.

2 結(jié)果與討論

2.1 ECL傳感器構(gòu)建及機理探究

HMPB金屬有機框架大的比表面積和過氧化物酶特性在葡萄糖、H2O2等生物分子檢測領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用.因此，本文基于HMPB@GOx復(fù)合物原位生成并迅速催化H2O2分解設(shè)計了一種ECL傳感器用于葡萄糖的超靈敏檢測.圖1為HMPB@GOx復(fù)合物的合成及表征圖.以K3[Fe(CN)6]和PVP為原料合成了立方體PB納米顆粒，通過調(diào)控HCl刻蝕時間獲得合適的中空介孔普魯士藍.然后將HMPB與葡萄糖氧化酶(GOx)混合過夜，形成HMPB@GOx復(fù)合納米材料(圖1(A))，并將該復(fù)合納米材料通過靜電吸附修飾在電聚合PAA的玻碳電極表面構(gòu)建葡萄糖傳感器.通過掃描電子顯微鏡(SEM)，透射電子顯微鏡(TEM)對PB及HMPB的形貌及內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行表征，從圖1(B,C)可以看出，合成的PB是粒徑為80 nm左右均勻的立方體，刻蝕后HMPB的棱角變得柔和且中間出現(xiàn)大的空腔結(jié)構(gòu)，表明刻蝕成功.進而通過Zeta電位和電極表面阻抗譜的變化來探究HMPB@GOx復(fù)合物的形成及ECL傳感器的構(gòu)建過程，結(jié)果表明，帶負電荷PB經(jīng)過刻蝕，質(zhì)子由于靜電吸附殘留在HMPB中使其所帶負電荷急劇減少，當GOx與HMPB復(fù)合之后，所帶的負電荷反而增加，這是由于帶較多負電荷的GOx負載在HMPB的空腔及表面增加了復(fù)合物的Zeta電勢(圖1(D))，證明HMPB@GOx成功合成.提高導(dǎo)電性及酶在電極表面的固載效率是增強電化學(xué)傳感器靈敏度的關(guān)鍵因素，本文通過測定工作電極表面的阻抗探究電化學(xué)傳感器的構(gòu)建過程，如圖1(E)所示，相比干凈的玻碳電極，電聚合PAA之后阻抗有所減小，當HMPB@GOx修飾在電極表面后阻抗顯著增大(內(nèi)插圖為玻碳電極和聚合PAA后的放大圖)，這是由于導(dǎo)電聚合物PAA薄膜的引入加速了溶液中電荷在電極表面的聚集和電子的轉(zhuǎn)移速率，而HMPB表面負載大量的生物分子GOx抑制了電子的快速轉(zhuǎn)移，表明基于HMPB@GOx的葡萄糖電化學(xué)傳感器構(gòu)建成功.

2.2 條件優(yōu)化

測試條件的優(yōu)化對ECL傳感器靈敏度、穩(wěn)定性提高至關(guān)重要，本文主要從電聚合PAA量、電解液pH、發(fā)光試劑魯米諾濃度、GOx在HMPB上的負載量和HMPB的刻蝕時間等方面進行測試條件優(yōu)化.

2.2.1電聚合PAA量的優(yōu)化

玻碳電極作為ECL傳感器的反應(yīng)基底，適當?shù)母男阅茱@著增強魯米諾的ECL的發(fā)光強度.本文通過控制電聚合時間對電極表面PAA的量進行優(yōu)化，如圖2(A)所示，從0到5圈隨著聚合時間的增加ECL強度逐漸增大，隨后ECL強度迅速降低，這是由于PAA厚度過大使反應(yīng)物與電極之間的距離變大減緩其電子轉(zhuǎn)移速率，實驗證明電聚合5圈PAA的電極對HMPB@GOx吸附量及導(dǎo)電性能最好.圖2(B)為PAA電聚合過程的循環(huán)伏安圖，第一次電位掃描時苯胺聚合的氧化峰電位出現(xiàn)在較低的0.80 V，該電位與鉑電極和石墨烯電極(0.76 V)基本一致，在隨后的循環(huán)中，此電位保持不變，但電流隨循環(huán)次數(shù)的增加而增大.當電位反向掃描時，曲線上出現(xiàn)兩個還原峰，其峰電流強度也隨著掃描次數(shù)的增加而增大，這是由于電極表面生成聚苯胺量在增加，這兩個還原峰是由生成的氧化摻雜態(tài)聚苯胺的還原而引起的.

2.2.2測試pH的優(yōu)化

魯米諾作為化學(xué)發(fā)光的主體，其ECL強度與電解液pH有關(guān)，為提高該ECL葡萄糖傳感器的靈敏度，本文對電極修飾后測試pH進行優(yōu)化.如圖2(C)所示，pH在5.3～7.0范圍內(nèi)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號較弱，堿性環(huán)境下魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度迅速增大，至pH為8.3時達到最大，之后ECL強度迅速降低，這是由于葡萄糖氧化酶在強堿性條件下會迅速失活，因此選擇pH為8.3作為最優(yōu)的測試條件.

2.2.3魯米諾濃度的優(yōu)化

魯米諾作為電化學(xué)發(fā)光體，其濃度大小是決定其ECL強度最主要的因素.如圖2(D)所示，增加魯米諾濃度可增強ECL發(fā)光，當其濃度為50 μmol/L時，ECL信號強度最高，即該傳感器靈敏度最大.這是由于在等量的共反應(yīng)劑條件下，高濃度的魯米諾會發(fā)生部分聚集，限制了其ECL的增強幅度.

2.2.4GOx負載量的優(yōu)化

GOx作為葡萄糖的特異性催化劑，HMPB上的負載量的優(yōu)化是提高電化學(xué)發(fā)光性能重點考察因素之一.圖2(E)結(jié)果表明，隨著GOx質(zhì)量濃度增大，在HMPB表面上的負載效率增加，質(zhì)量濃度為20 g/L時負載量適中，其催化性能最優(yōu)，當GOx質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，電極表面電子的傳遞速率降低，而且包裹在內(nèi)部的HMPB不能有效催化H2O2分解使得ECL強度迅速降低.

2.2.5HMPB刻蝕時間優(yōu)化

HMPB比表面積的優(yōu)化是提高GOx負載量的關(guān)鍵，本文通過調(diào)控HCl對PB的刻蝕時間來控制HMPB空腔大小.圖2(F)結(jié)果表明，隨著刻蝕時間的增加HMPB的空腔逐漸增大，對GOx的負載量增多，能夠有效增強魯米諾的ECL強度，4.0 h為最佳.當刻蝕時間達到4.5 h時，HMPB的產(chǎn)率和ECL強度均迅速降低，表明部分PB被刻蝕完全，HMPB的立方結(jié)構(gòu)出現(xiàn)殘缺導(dǎo)致負載的GOx的泄露.當刻蝕時間為8.0 h時，PB被刻蝕完全，無法形成HMPB.

2.3 葡萄糖測定

在上述最優(yōu)條件下，該HMPB@GOx傳感器對葡萄糖進行了定量測定.如圖3所示，ECL強度隨著葡萄糖濃度增加逐漸增強，僅在4 s達到最大，且ECL強度在葡萄糖濃度為3.3×10-2～167.0 μmol/L范圍成良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2達到0.99，檢出限為2.1×10-2μmol/L(LOD=3S/N)，這與以往報道的葡萄糖檢測體系相比，表現(xiàn)出較高的靈敏度和較低的檢測限(表1).這是由于雙功能的HMPB作為GOx的載體在不降低酶活性的前提下提高了GOx在電極表面的固載效率，同時催化原位生成的H2O2快速分解產(chǎn)生活性氧使得魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度級聯(lián)放大，從而實現(xiàn)對葡萄糖的超靈敏測定.

表1 葡萄糖檢測方法與報道的ECL葡萄糖生物傳感器分析性能比較

2.4 選擇性和穩(wěn)定性研究

生物體液中存在多種電化學(xué)活性的物質(zhì)，如抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)和多巴胺(DA)等，這些物質(zhì)在葡萄糖檢測過程中會成為重要的干擾因素.因此，良好的葡萄糖選擇性是血糖檢測非常重要的指標.如圖4(A)所示，加入6.7 μmol/L的 AA，DA，UA后，該傳感器的ECL強度幾乎不發(fā)生變化，當加入6.7 μmol/L葡萄糖后，傳感器的ECL強度顯著增加,結(jié)果表明,AA，DA，UA對葡萄糖檢測的影響可忽略不計，該傳感器具有良好的抗干擾能力.同時，考察了該ECL傳感器的穩(wěn)定性，在6.7 μmol/L的葡萄糖溶液中經(jīng)過19次循環(huán)，ECL強度仍保持在95%以上，且相對標準偏差為2.74%(圖4(B))，表明傳感器具有較好的穩(wěn)定性及抗干擾能力.

2.5 實際樣品測定

為評價該傳感器在實際樣品中的檢測能力，分別將正常人的血清用PBS緩沖溶液(pH=8.3)10倍，100倍，1 000倍，5 000倍和10 000倍稀釋后檢測葡萄糖含量.如圖5所示,ECL強度與血清稀釋倍數(shù)在100～10 000倍范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)性系數(shù)R2=0.97,說明本文構(gòu)建的傳感器對血清中的葡萄糖檢測非常靈敏.實際工作中，選取1 000倍稀釋的血清作為實際樣品進行測試(表2)，結(jié)果與臨床結(jié)果基本吻合，表明基于HMPB@GOx構(gòu)建的ECL傳感器具有臨床檢測的應(yīng)用潛力.

表2 1 000倍稀釋血清中葡萄糖測定

3 結(jié) 論

本文通過簡單的水熱-刻蝕法合成了一種立方結(jié)構(gòu)的中空介孔HMPB納米顆粒，控制刻蝕時間調(diào)控其空腔及比表面積，負載大量的GOx制備出HMPB@GOx納米復(fù)合物，進而結(jié)合經(jīng)典的魯米諾-H2O2電化學(xué)發(fā)光體系構(gòu)建超靈敏葡萄糖傳感器.電化學(xué)測試結(jié)果表明該ECL傳感體系對葡萄糖的檢測范圍為3.3×10-2～167.0 μmol/L，檢測限低至2.1×10-2μmol/L，成功檢測實際血清中的葡萄糖含量.而且該傳感體系在其他電活性物質(zhì)如抗壞血酸(AA)，多巴胺(DA)和尿酸(UA)共存時仍對葡萄糖具有良好的選擇性和穩(wěn)定性.這些優(yōu)異特性主要歸因于具有良好生物相容性的HMPB作為載體大量負載高活性的GOx催化葡萄糖氧化在電極表面原位生成H2O2，進而作為H2O2的模擬酶迅速催化H2O2分解產(chǎn)生活性氧，級聯(lián)增強魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度.本研究拓寬了酶及納米材料在H2O2,葡萄糖檢測中的應(yīng)用，該傳感器檢測速度快、構(gòu)造簡單、靈敏度高，具有開發(fā)糖尿病患者血清中葡萄糖便攜檢測器件的潛力.