朱衛(wèi)健，何 穎，黃慕芳，付社竹，王小琪，李志新，陳麗君，李小亮

(珠海市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院 血液風(fēng)濕科, 廣東 珠海 519000)

β-地中海貧血(β-thalassemia)是一組先天遺傳性溶血性疾病，也是世界上最常見(jiàn)的單基因遺傳病之一，在我國(guó)南方及部分沿海地區(qū)發(fā)病率高。對(duì)于中間型及重型-地中海貧血臨床上缺乏有效的治療手段，這些患者需要定期輸血、祛鐵治療來(lái)維持生命，患者總生存時(shí)間短，生存質(zhì)量及預(yù)后差。目前治愈方法包括，骨髓移植和基因或細(xì)胞治療，但治療費(fèi)用昂貴，難以獲得匹配的骨髓，特別是基因治療，其安全性仍受到挑戰(zhàn)。

藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生胎兒血紅蛋白(HbF)來(lái)替代或是逆轉(zhuǎn)α/β珠蛋白比例失調(diào)，能減輕β-地中海貧血的癥狀，被認(rèn)為是治療重型β-地中海貧血的新策略，Chen等[1]的多中心、安慰劑、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)顯示沙利度胺治療β-地中海貧血療效顯著，總有效率達(dá)69.4%，使患者脫離輸血或減少輸血，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。

MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度為19～22個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，參與轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)節(jié)，并在多種細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡[2-3]。越來(lái)越多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)在β-地中海貧血的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，這些miRNAs可起到改善或加重β-地中海貧血的作用，miRNAs與靶mRNA的3'UTR區(qū)結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)HbF的表達(dá)，從而影響β-珠蛋白合成減少或缺失引起的嚴(yán)重貧血。隨著miRNAs的更深入研究，科學(xué)家們開(kāi)始探索miRNA在不同類(lèi)型的血紅蛋白病調(diào)節(jié)中的作用，已有充分證據(jù)表明，miRNAs對(duì)紅細(xì)胞生成至關(guān)重要，在HbF表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-26b、miR-151-3p、miR-29a-3p、miR-99b-5p通過(guò)抑制BCL11A，從而誘導(dǎo)γ-珠蛋白表達(dá)，用于治療地中海貧血及鐮狀細(xì)胞性貧血(SCA)等遺傳性血紅蛋白病[5-7]。而miR-15a和miR-16-1通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子MYB3與HbF升高相關(guān)聯(lián)，miR-223-3p靶向LMO2的3'UTR下調(diào)γ-珠蛋白表達(dá)[8]，這些miRNAs可能是誘導(dǎo)HbF表達(dá)的靶分子。

我們從文獻(xiàn)報(bào)道與地中海貧血相關(guān)的候選miRNAs篩選出miR-223-3p，檢測(cè)miR-223-3p在沙利度胺治療β-地中海貧血患者在服藥前后的表達(dá)水平變化及分析miR-223-3p與血紅蛋白濃度及HbF的相關(guān)性，以期為藥物誘導(dǎo)γ-珠蛋白轉(zhuǎn)錄后機(jī)制探討提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1病例選擇 選取自2018年2月-2020年12月在我院參加臨床試驗(yàn)的輸血依賴(lài)型β-地中海貧血患者8例，其中男性3例，女性5例，健康對(duì)照組選用同期在珠海市人民醫(yī)院的健康體檢者8例，無(wú)相關(guān)疾病，血常規(guī)正常。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥14歲, 經(jīng)基因檢查診斷符合中-重型β-地中海貧血；②ECOG體力評(píng)分0～3分，需定期輸血及祛鐵治療；③末次輸血距入組時(shí)間大于14天。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并感染性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能不全等；②3個(gè)月內(nèi)有動(dòng)靜脈血栓形成病史者；③合并其他原因引起的貧血未糾正者；④精神病患；⑤不能口服藥物患者；⑥妊娠、哺乳期女性和不愿采取避孕措施的育齡受試者；⑦ 對(duì)本品過(guò)敏者、受試期間需要從事駕駛員及機(jī)器操作職業(yè)者。研究經(jīng)珠海市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)，所有患者或其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。沙利度胺組口服沙利度胺100 mg/次，1次/d，于晚餐后頓服，可耐受者3天后加量到150 mg/d。

1.2試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液、Trizol購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、miRNAs引物、加尾法miRNA qtPCR試劑盒(廣州銳博生物公司)，酶標(biāo)儀(Thermo Scientific, 美國(guó))，Real-Time PCR 儀(Bio-Rad, 美國(guó))、普通 PCR 擴(kuò)增儀(Applied Biosystems, 美國(guó))。

1.3外周血單個(gè)核細(xì)胞及總RNA的提取 早晨空腹，分別抽取輸血依賴(lài)型β-地中海貧血患者治療前和治療后及正常對(duì)照組靜脈血5 ml，EDTA抗凝，1 500 r/min離心10 min，去除血漿后的細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)所在的白膜層細(xì)胞，PBS洗滌2次，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。?yīng)用Trizol提取β-地中海貧血患者治療前和治療后及正常對(duì)照組PBMCs細(xì)胞中總的RNA。

1.4qRT-PCR檢測(cè)各組miR-223-3p表達(dá)水平 將各組總RNA采用逆轉(zhuǎn)錄法合成相應(yīng)cDNA，采用 CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)程序檢測(cè), miR-223-3p引物為：5’-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3’，計(jì)算基因表達(dá)水平時(shí), 采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-223-3p的相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的基因表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床資料比較 8例β-地中海貧血中，有4例已行脾切除。β-地中海貧血患者的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞比容 (Hct)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量(MCH)，均顯著降低(P<0.05)，血小板計(jì)數(shù)(PLT)及白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)均升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2β-地中海貧血患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-223-3p表達(dá)水平 本研究發(fā)現(xiàn)β-地中海貧血患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-223-3p相對(duì)表達(dá)量為0.191±0.089，顯著高于對(duì)照組0.053±0.039(P=0.003)，口服沙利度胺后miR-223-3p相對(duì)表達(dá)量為0.106±0.047(P=0.047)，表達(dá)量下降，與β-地中海貧血患者服藥前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-223-3p在各組中的相對(duì)表達(dá)水平 注：*P<0.05

2.3miR-223-3p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性 β-地中海貧血患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-223-3p表達(dá)水平與Hb水平(r=-0.488，P=0.015)，HCT(r=-0.420，P=0.004) 呈顯著負(fù)相關(guān)，見(jiàn)表2、圖2。

表2 miR223-3p相對(duì)表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

圖2 miR-223-3p相對(duì)表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

β-地中海貧血一種常染色體隱性遺傳的血紅蛋白疾病，是由于β珠蛋白基因突變或缺失引起的相應(yīng)β肽鏈合成不足或缺如，相對(duì)過(guò)剩的α鏈沉積于紅系細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，導(dǎo)致無(wú)效紅細(xì)胞生成、慢性溶血、微血管阻塞等病理改變，β-地中海貧血中α/β鏈不平衡是其發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)[9]，增加HbF是克服貧血和無(wú)效造血的重要治療手段。正常的人類(lèi)個(gè)體在發(fā)育過(guò)程中，存在珠蛋白基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換，出生后γ珠蛋白基因逐漸關(guān)閉，主要表達(dá)β基因。誘導(dǎo)γ-珠蛋白鏈表達(dá)可以平衡病理性α珠蛋白鏈增多，從而改善貧血和終止輸血依賴(lài)[10]。

在許多研究和綜述文獻(xiàn)中，對(duì)藥物在γ珠蛋白基因激活中的可能機(jī)制進(jìn)行了闡述?？茖W(xué)研究已經(jīng)確定的HbF分子調(diào)控因子，包括BCL11A、MYB、HBSIL、KLF1和miRNAs[11]。在這些調(diào)控通路中，miRNAs對(duì)HbF誘導(dǎo)的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后通路起著重要作用。

Chen等[1]的多中心、隨機(jī)、雙盲的2期臨床試驗(yàn)中顯示，接受沙利度胺治療的β-地中海貧血患者的 Hb 中位濃度升高達(dá)到了14.0(2.5～37.5) g/L ，而接受安慰劑治療的患者的Hb濃度沒(méi)有顯著變化。在12周內(nèi)，接受沙利度胺和安慰劑治療的患者的平均紅細(xì)胞輸注量分別為(5.4±5.0) U 和(10.3±6.4) U(P<0.01)，在擴(kuò)展階段，沙利度胺治療24周后Hb濃度持續(xù)增加，達(dá)到(104.9±19.0) g/L，無(wú)需輸血。表明沙利度胺為有效的HbF誘導(dǎo)劑，同時(shí)以往的研究揭示，沙利度胺誘導(dǎo)胎兒Hb的可能機(jī)制包括：①有效增強(qiáng)源于β珠蛋白基因突變的造血干細(xì)胞(HSCs)紅系祖細(xì)胞中GATA-1和EKLF的表達(dá)，誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)HbF[12]；②由于炎性細(xì)胞因子如由核因子κB(NF-κB)誘導(dǎo)抑制腫瘤壞死因子(TNF-α)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和前列腺素E2(PGE2)合成與釋放的活性氧(ROS)的增加有關(guān)，ROS可以啟動(dòng)P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，導(dǎo)致HbF水平升高[13]；③通過(guò)誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子5(signal transducer and activator of transcription 5, STAT5)和促進(jìn)紅細(xì)胞生成細(xì)胞凋亡的外部通路的抑制導(dǎo)致增加GATA-1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而GATA-1能有效地誘導(dǎo)γ珠蛋白基因表達(dá)HbF[14]。

miRNAs通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)HbF誘導(dǎo)方面的研究較少，本研究檢測(cè)服用沙利度胺后miR-223-3p表達(dá)水平的變化，推測(cè)其誘導(dǎo)HbF的可能機(jī)制。

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，β-地中海貧血患者的外周血miRNA改變了2 833個(gè)基因。來(lái)自β-地中海貧血患者差異調(diào)控miRNA已經(jīng)被預(yù)測(cè)其廣泛調(diào)控的功能，β-地中海貧血患者的血漿外泌體具有許多差異表達(dá)的miRNA譜，這些miRNA譜可能參與各種生物過(guò)程。Sun等[8]研究將LMO2的3' uts及其種子序列突變版本克隆到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)下游，并評(píng)估m(xù)iR-223下調(diào)熒光素酶表達(dá)的能力。發(fā)現(xiàn)miR-223-3p與LMO2野生型3'UTR結(jié)合，降低螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，此外，在K562細(xì)胞中，MiR-223-3p模擬物顯著下調(diào)了LMO2和γ-珠蛋白的表達(dá)，因此，判斷miR-223-3p通過(guò)LMO2靶向下調(diào)γ-珠蛋白表達(dá)。

我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，檢測(cè)文獻(xiàn)中報(bào)道過(guò)紅系調(diào)控有意義的miRNAs，篩選miR-223-3p這個(gè)候選miRNAs，并對(duì)輸血依賴(lài)型β-地中海貧血及口服沙利度胺有效的患者進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-223-3p在輸血依賴(lài)型β-地中海貧血患者中高表達(dá)，口服沙利度胺后miR-223-3p 表達(dá)水平下降。

這些結(jié)果表明，miRNA是β-地中海貧血診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，基于miRNA的治療策略可能被用作有效治療β-地中海貧血的方法。對(duì)紅細(xì)胞生成中miRNAs的研究闡明了其潛在的調(diào)控機(jī)制，并促進(jìn)了相關(guān)診斷和治療的發(fā)展。然而，需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證這一假設(shè)，特別是通過(guò)細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)明確具體的調(diào)控通路?？偟膩?lái)說(shuō), 沙利度胺通過(guò)下調(diào)miR-223-3p 表達(dá)水平，可能使調(diào)控γ珠蛋白基因的重新激活，從而改善β-地中海貧血的病理生理和臨床癥狀，miR-223-3p有可能成為β-地中海貧血新的治療靶點(diǎn)。