朱文娟，黎麗敏，李錦妹，陳文靜（. 惠州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 惠州 56003；. 嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東梅州 5403）

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb．）Breit.的干燥塊莖，有降逆止嘔、鎮(zhèn)咳祛痰、抗?jié)?、抗血栓、抗腫瘤、抗氧化、抗癲癇、助眠和糖皮質(zhì)激素樣等作用[1-4]。在抗擊新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）時(shí)，中藥湯劑發(fā)揮著重要的作用，其中清肺排毒湯因其良好的治療作用備受推崇，而半夏為其組方藥之一[5]。半夏為臨床常用的中藥，但生品有毒，故不作內(nèi)服。通過炮制降低半夏毒性、增強(qiáng)其藥效，有利于臨床應(yīng)用和儲存。常見的半夏炮制品有法半夏、姜半夏和清半夏，均收載于《中國藥典》2020年版一部中藥飲片部分。飲片的炮制方法為煎煮、浸泡、晾干等。法半夏炮制過程中需加入甘草和生石灰，姜半夏需加入白礬和生姜，清半夏需加入白礬[6]。半夏和甘草沒有明顯的抑菌性[7]；生姜對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑制作用，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌有強(qiáng)烈的抑制作用[8]；白礬對白假絲酵母菌、大腸埃希菌和枯草桿菌有明顯的抑制作用[9]。3 種半夏在炮制過程中使用不同的輔料，推測其抑菌性可能會(huì)有不同，因而其微生物限度方法適用性實(shí)驗(yàn)有差異。

2020年版《中國藥典》僅對中藥提取物、直接口服及泡服飲片進(jìn)行了微生物限度規(guī)定，提出了耐熱菌總數(shù)的概念和檢測方法，但沒有對其限值進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)定，其他類型的中藥飲片也沒有微生物限度控制的規(guī)定，且缺乏針對不同品種飲片的微生物限度檢查法。中藥來源主要分為植物、動(dòng)物和礦物三大類，大多數(shù)中藥飲片炮制過程簡單，經(jīng)過凈選、洗潤、干燥等過程，所攜帶的微生物有所降低，但仍有不同程度的附著和殘留，若存放不當(dāng)，在適宜的溫度和濕度下，微生物很容易生長繁殖[10]。在污染嚴(yán)重的情況下，其附帶的有害微生物、代謝毒素等，即使經(jīng)過生產(chǎn)加工仍無法去除，進(jìn)入終產(chǎn)品后將或多或少給患者帶來風(fēng)險(xiǎn)[11]。

近年來，中藥飲片的微生物污染情況受到越來越多的關(guān)注，張平等[10]對50 種中藥煎煮類飲片微生物污染情況進(jìn)行了初步探索，范一靈等[12]也對上海地區(qū)10 種中藥飲片微生物情況進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)需氧菌總數(shù)（TAMC）最高值可達(dá)107～108cfu·g-1，霉菌和酵母菌總數(shù)（TYMC）最高值可達(dá)105～107cfu·g-1，耐熱菌檢出率高達(dá)50%，60 種需煎煮類中藥飲片，炮制方法為煮制類、炒制類和蒸制類的只占22%，切制、凈制、敲制等占78%。切制、凈制、敲制等炮制方式并不能降低中藥飲片中的微生物數(shù)量，反而可能因?yàn)榧庸み^程受到微生物的二次污染，因此，目前國內(nèi)研究大多聚焦在此類中藥飲片。而蒸、煮、炒制類的中藥飲片微生物限度檢查法和污染情況研究較少，本文選擇半夏的3 種不同炮制品，炮制方式為加輔料煮制，同時(shí)建立3 種半夏的微生物限度檢查法并對購自全國11 家企業(yè)32 批半夏飲片進(jìn)行微生物污染調(diào)查，數(shù)據(jù)更有代表性和可比性，在初步探明半夏飲片的微生物危害因子的基礎(chǔ)上，為中藥飲片微生物污染風(fēng)險(xiǎn)評估、蒸煮類炮制方式的中藥飲片微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的制訂和完善提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS-1600Ⅱ級生物安全柜（蘇州安泰），BSP-400 生化培養(yǎng)箱（上海博訊），BMJ-400C 霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊），VITEK 2 Compact 30 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃），Stemi 508 顯微鏡（德國蔡司）。

1.2 中藥飲片

法半夏13 批、姜半夏12 批、清半夏7 批購自11 家企業(yè)，均由筆者按《中國藥典》2020年版各藥材項(xiàng)下相關(guān)要求進(jìn)行鑒定。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基（TSB）、麥康凱液體培養(yǎng)基（MCB）（批號分別為1080935、K1459Y，廣東環(huán)凱生物科技有限公司）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MCA）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）（批號分別為20011411、19121261、2004282、18062761、190627，北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（EEB）、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號分別為20201128、20210108，北京奧博星生物技術(shù)有限公司），培養(yǎng)基適用性檢查均符合要求[13]。

1.4 試劑

VITEK 2 革蘭氏陰性鑒定卡、革蘭氏陽性鑒定卡、芽孢桿菌鑒定卡（批號分別為2411302103、2421137403、2391523503，生物梅里埃美國股份有限公司）。

1.5 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白假絲酵母菌（Candida albicans）[CMCC（B）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，定量菌株（100 ～1000 cfu/100 μL）；乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi）[CMCC（B）50094]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，定量菌株（10 ～100 cfu/100 μL）；所有菌種均購于杭州微球科技有限公司，經(jīng)菌種確認(rèn)驗(yàn)收合格。

2 方法

按2020年版《中國藥典》四部中藥飲片微生物限度檢查項(xiàng)下的相關(guān)要求，先進(jìn)行方法適用性實(shí)驗(yàn)，以符合要求的稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進(jìn)行供試品檢查。耐熱菌及控制菌檢查中劃線分離到的菌株用 VITEK 2 進(jìn)行鑒定。

2.1 菌液制備

取復(fù)溶溶液1.1 mL，加入菌種凍干西林瓶中，充分混勻，即得方法適用性實(shí)驗(yàn)所需濃度的菌液。

2.2 供試液制備

取25 g 樣品，加入225 mL TSB 中，振蕩15 min，取其1∶10 的清液為供試液。

2.3 方法適用性實(shí)驗(yàn)

法半夏：選取亳州市中藥飲片廠（批號：200701）、北京仟草中藥飲片有限公司（批號：D200601001）、北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司（批號：20200521）各1 批樣品。

姜半夏：選取亳州市中藥飲片廠（批號：200202）、北京仟草中藥飲片有限公司（批號：D191116001）、北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司（批號：20200701）各1 批樣品。

清半夏：北京仟草中藥飲片有限公司（批號：D200103001）、北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司（批號：20200127）、鄭州瑞龍制藥股份有限公司（批號：18020401）各1 批樣品。

中藥飲片中微生物數(shù)量相對較高[12]，為避免影響微生物回收結(jié)果，先對上述樣品各稱取25 g后，進(jìn)行115℃、20 min 滅菌，再進(jìn)行方法適用性實(shí)驗(yàn)。

2.4 微生物的計(jì)數(shù)

取供試液及2 個(gè)連續(xù)10 倍稀釋級，分別于TSA和SDA 中培養(yǎng)，TSA 置32.5℃下培養(yǎng)5 d，SDA 置22.5℃下培養(yǎng)7 d，分別計(jì)數(shù)平皿需氧菌落數(shù)。

取供試液10 mL 經(jīng)沸水浴30 min 處理后迅速冷卻，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟和培養(yǎng)條件同TAMC 計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，測定耐熱菌總數(shù)。將耐熱菌進(jìn)一步分離純化，采用 VITEK 2 進(jìn)行菌株鑒定。

2.5 控制菌的檢查

2.5.1 耐膽鹽革蘭氏陰性菌 取供試液，于25℃下預(yù)培養(yǎng)2 h，取相當(dāng)于0.1、0.01、0.001 g 樣品的供試品溶液加入至10 mL EEB 中，按藥典要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)，并查表得出定量結(jié)果[13]。

2.5.2 大腸埃希菌 取供試液10 mL，加至100 mL TSB 中，混勻，按藥典要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)[13]，若MCA 平板上有菌落生長，挑取單菌落接種至TSA 平板，32.5 ℃下培養(yǎng)24 h 后，采用VITEK 2 進(jìn)行菌株鑒定。

2.5.3 沙門菌 取10 g 供試品，加入100 mL TSB 中，混勻，按藥典要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)[13]，若XLD 平板上有菌落生長，挑取單菌落接種至TSA 平板，32.5 ℃下培養(yǎng)24 h 后，采用VITEK 2進(jìn)行菌株鑒定。

3 結(jié)果

3.1 微生物限度檢查法的建立

采用常規(guī)平皿法，在供試液濃度為1∶10 時(shí)，3 種飲片的各菌回收比值均為0.5 ～2.0，結(jié)果見表1；控制菌檢查中，均能檢出實(shí)驗(yàn)菌。3 種半夏均無抑菌性，可用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn)。

表1 半夏炮制飲片微生物限度方法適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Applicability test for microbial limit test of Pinelliae rhizome

3.2 微生物限度檢查結(jié)果

3.2.1 需氧菌、霉菌和酵母菌、耐熱菌數(shù)測定32 批樣品的需氧菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)結(jié)果介于10 ～105cfu·g-1，其中需氧菌、霉菌和酵母菌的主要分布：法半夏在102～104cfu·g-1和10 ～102cfu·g-1，姜半夏和清半夏在103～104cfu·g-1和102～104cfu·g-1，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 TAMC 分布圖Fig 1 TAMC results

圖2 TYMC 分布圖Fig 2 TYMC results

32 批半夏中，共有15 批檢出耐熱菌，計(jì)數(shù)結(jié)果在10 ～550 cfu·g-1，檢出率為46.9%。耐熱菌鑒定結(jié)果主要為芽孢桿菌屬，有地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、堅(jiān)固芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌；檢出2 批少動(dòng)鞘氨醇單胞菌。結(jié)果表明，半夏經(jīng)過30 min 煎煮，大部分條件致病菌可得到有效控制，但仍有不少芽孢桿菌能存活下來。

3.2.2 控制菌檢查 3 批耐膽鹽革蘭氏陰性菌定量實(shí)驗(yàn)呈陽性，污染范圍均在10 ～102cfu·g-1，3 種半夏各占1 批。結(jié)果表明，3 種半夏的耐膽鹽革蘭氏陰性菌負(fù)載水平較低。32 批半夏飲片均未檢出大腸埃希菌和沙門菌，但有13 批在控制菌檢查中發(fā)現(xiàn)可疑菌落，主要為以下5 類菌：成團(tuán)泛菌屬、非脫羧勒克氏菌、肺炎克雷伯菌、赫氏埃希菌和陰溝腸桿菌，分別占30.7%、23.1%、15.4%、15.4%、15.4%。

4 討論

傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)凍干菌株在復(fù)蘇、傳代和稀釋中步驟煩瑣、操作耗時(shí)。工作菌液需稀釋多個(gè)數(shù)量級，才能達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求，不僅對實(shí)驗(yàn)者的稀釋操作要求較高，對每次傳代培養(yǎng)的菌液濃度也有嚴(yán)格要求；而實(shí)際操作中，工作菌液的濃度常因傳代菌株的活性、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和保存溫度及時(shí)間而產(chǎn)生較大的差異，實(shí)驗(yàn)者往往會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)后菌液組的數(shù)量達(dá)不到藥典要求而不得不重復(fù)方法適用性實(shí)驗(yàn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力?！吨袊幍洹?020年版四部9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則里指出，可使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株作為工作菌株[13]。本法適用性實(shí)驗(yàn)中，使用的是商品化定量菌株，只需將定量菌株按操作要求進(jìn)行復(fù)溶即可，且菌量穩(wěn)定。定量菌株的使用，既縮短了菌液的培養(yǎng)和配制稀釋的時(shí)間，又保證了菌活性和濃度，省時(shí)省力，值得推廣。

3 種半夏在炮制過程中，使用不同的輔料進(jìn)行煎煮、浸泡、洗凈及晾干。雖然部分輔料（如姜、明礬等）存在一定的抑菌性，但經(jīng)過炮制后，濃度被稀釋，抑菌效力減弱，故3 種半夏在微生物限度的方法適用性的結(jié)果均無抑菌性，可采用常規(guī)平皿法進(jìn)行微生物限度檢查。也正因?yàn)? 種半夏炮制過程中使用到含抑菌性的輔料，且在炮制煎煮過程中滅活部分的微生物，半夏飲片相較于僅進(jìn)行簡單晾曬切割的中藥飲片，如通草[14]、紅花[15]，魚腥草[16]等，本底污染微生物的負(fù)載量要少2 ～3 個(gè)對數(shù)級別。半夏飲片的控制菌污染主要為成團(tuán)泛菌屬、非脫羧勒克氏菌、肺炎克雷伯菌肺炎、赫氏埃希菌和陰溝腸桿菌，雖然不是2020年版《中國藥典》要求的控制菌，但均為條件致病菌，在檢查中應(yīng)關(guān)注。

半夏的耐熱菌污染主要來自于兩大類，一類是耐熱的革蘭氏陽性芽孢桿菌，另一類是革蘭氏陰性條件致病菌。芽孢桿菌屬主要源于土壤，枯草芽孢桿菌雖為常見的環(huán)境菌，但仍會(huì)導(dǎo)致部分人群感染[17]；此次在耐熱菌檢測中檢出少動(dòng)鞘氨醇單胞菌，該菌為革蘭氏陰性桿菌，是院內(nèi)感染的致病菌之一[18]。半夏常以煎煮后的湯劑形式服用，近幾年流行養(yǎng)生茶直接泡服，參照2020年版《中國藥典》，按直接口服及泡服飲片要求，本次實(shí)驗(yàn)霉菌和酵母菌總數(shù)中，有7 批次不符合要求；且從15批半夏中檢出耐熱菌，為了保障群眾的用藥安全，應(yīng)對半夏的上述兩項(xiàng)微生物指標(biāo)進(jìn)行限值規(guī)定。

在方法學(xué)適用性實(shí)驗(yàn)中，對樣品先進(jìn)行115℃、20 min 滅菌處理以減少本底菌數(shù)量過大的干擾，摸索出合適的限度方法后，再對未滅菌的樣品進(jìn)行污染性探究實(shí)驗(yàn)。在TAMC、TYMC中，相鄰10 倍稀釋級別的菌落數(shù)均呈現(xiàn)10 倍數(shù)值左右的比例，再次表明樣品不具有抑菌性。若樣品相鄰稀釋級別的菌落數(shù)倍數(shù)差異不成比例時(shí)，應(yīng)考慮樣品的抑菌因子被滅菌處理所破壞，應(yīng)調(diào)整樣品前處理的滅菌溫度和時(shí)間，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，減少對抑菌因子的破壞。

本次實(shí)驗(yàn)未檢出大腸埃希菌和沙門菌，但并不代表此類致病菌不存在于半夏樣品中。本次實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量偏少，接下來將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量，尋找各地有代表性的樣品，同時(shí)開展更多炮制后可降低微生物數(shù)量的中藥飲片的微生物限度方法建立和污染調(diào)查，為藥典制訂該類中藥飲片的微生物限值提供數(shù)據(jù)支持。

2020年版《中國藥典》新增了中藥材飲片的微生物限度檢查方法，目前僅對中藥提取物、直接口服及泡服飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)提出要求。而歐洲藥典7.0 版（EP7.0）、日本藥典16 版（JP16）和美國藥典36 版（USP36）早已明確需煎煮類的中藥材飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，包括TAMC、TYMC 以及控制菌[19-21]。范一靈等[12]的研究表示，炮制過程不涉及熱加工和涉及熱加工的中藥飲片的需氧菌和耐熱菌計(jì)數(shù)有顯著性差異，熱加工處理的中藥飲片，需氧菌和耐熱菌計(jì)數(shù)比不涉及熱加工的低。張平等[10]分析50 種藥材飲片，非熱加工方式切制凈制飲片的微生物負(fù)載最高，熱加工方式的煮制、炒制、蒸制飲片次之，熱加工與非熱加工的炮制方式對需氧菌、霉菌和酵母菌有明顯差異（P＜0.05），對耐熱菌無顯著差異（P＞0.05）。

筆者認(rèn)為，應(yīng)根據(jù)中藥材飲片的炮制方式和服用方式，將中藥飲片進(jìn)行分類，炮制方式分為炮制或預(yù)處理后不能降低微生物數(shù)量、炮制后可降低微生物數(shù)量、直接干燥或打粉三類，服用方式分為不需煎煮和需煎煮兩類，根據(jù)不同的炮制方式和服用方式的相互組合，增加TAMC、TYMC、耐熱菌的限值指標(biāo)?？刂浦兴幉娘嬈奈⑸镏笜?biāo)，降低藥材本身的各類污染菌，可以在一定程度上延長飲片的保存期限，保證藥材的質(zhì)量和藥效。此外，中藥材飲片的微生物數(shù)量得到一定的控制后，也可降低下游中成藥制劑的微生物負(fù)載量，減少因原材料中藥材帶來的微生物污染，在一定程度上減輕制藥企業(yè)的產(chǎn)品過程控制和終端滅菌的壓力。