王笑笑，宋鵬博，王 鑫，周 鋒，張傲琰，張海龍，張澤源，馮 毅，孫道杰

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥(L.)是世界上最重要的糧食作物之一，在人類生產(chǎn)生活中發(fā)揮著不可替代的作用。近年來，由于氣候變暖導(dǎo)致小麥穗部真菌病害發(fā)生率和嚴(yán)重度增加，品種的花藥伸出特性對小麥?zhǔn)诜劢Y(jié)實(shí)性和赤霉病抗性的影響日益凸顯，嚴(yán)重影響小麥生產(chǎn)。另外，花藥伸出特性也是小麥雜種優(yōu)勢利用的重要研究內(nèi)容。因此，發(fā)掘影響花藥伸出特性的QTL，可為改良小麥品種的揚(yáng)花期相關(guān)性狀提供參考。

迄今為止，國內(nèi)外許多學(xué)者對小麥的開花期性狀進(jìn)行了研究，并取得了一定的進(jìn)展，但對影響花藥發(fā)育和花藥伸出特性的遺傳機(jī)制知之甚少?；ㄋ幧斐鎏匦允腔ㄋ幵陂_花期間從小花中伸出來的一種現(xiàn)象。小麥的穗由穗軸和小穗組成，每個小穗包含2～5朵小花，每朵小花又包括1片外稃、1片內(nèi)稃、3枚雄蕊、1枚雌蕊和1對漿片。小花開放主要受漿片膨脹的控制。在小麥開花時，位于外稃和子房基部之間的一對漿片在開花時迅速膨脹，撐開堅硬的外穎，使花藥和柱頭伸出。當(dāng)漿片膨大失敗沒有足夠的機(jī)械力撐開穎殼時，就會阻礙花粉流動，導(dǎo)致閉穎開花和自花授粉?；ㄋ幧斐鼍哂袕?fù)雜的遺傳學(xué)特性，并受多方面因素的影響，穗和小穗的大小及結(jié)構(gòu)、穎片的韌性、漿片膨脹程度、花藥大小、花絲長度以及開花持續(xù)時間等都有可能影響花藥的伸出。

花藥伸出特性一直是育種者關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，赤霉病的嚴(yán)重程度與花藥伸出特性緊密相關(guān)，大部分花藥伸出特性QTL與赤霉病抗性QTL區(qū)間相同。殘留的花藥是赤霉病侵染初期的主要目標(biāo)。由于開花時花藥不能按時完全散落，導(dǎo)致授粉后的小花不能及時閉合，為真菌侵染提供了一個入口，因而快速且完全地花藥伸出過程可以在一定程度上阻止赤霉病侵染?；ㄋ幧斐鎏匦允怯啥嗷蚩刂频臄?shù)量性狀。目前研究報道的與小麥花藥伸出特性相關(guān)的QTL分別位于1A、1B、1D、2A、2B、2D、3B、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B和7A染色體上。大部分影響花藥伸出特性的QTL效應(yīng)都比較小，在已報道的主效QTL中，除了與和基因緊密連鎖的QTL外，僅Muqaddasi等在5A染色體上也發(fā)現(xiàn)了一個主效QTL。由此可見，與花藥伸出特性相關(guān)的穩(wěn)定的主效QTL較少，這可能與選擇的親本材料有關(guān)。因此，本研究以半閉穎小麥品種周8425B和開穎小麥品種小偃81為親本構(gòu)建的含102個株系的RIL群體為研究對象，利用90K SNP芯片對花藥伸出特性進(jìn)行QTL定位，挖掘新的能夠穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，以期為分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以半閉穎小麥品種周8425B和開穎小麥品種小偃81構(gòu)建的包含102個株系的F代RIL群體為材料，于2019年10月播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)站(用E1表示)，間隔1個月為晚播環(huán)境(用E2表示)；于2020年10月也播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)站(用E3表示)，間隔1個月為晚播環(huán)境(用E4表示)。試驗(yàn)均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，重復(fù)3次。每個株系種植2行，行長2 m，每行50株，行距0.25 m。其他田間管理措施同當(dāng)?shù)厣a(chǎn)管理。

1.2 表型鑒定

在小麥開花期間，每個株系選取長勢良好且均勻一致的3個單株(排除邊際效應(yīng))，在所有環(huán)境中評估花藥伸出的情況。利用并改進(jìn)Hanafi等報道的兩種方法進(jìn)行表型鑒定。方法1：于小麥花后5～7 d，取長勢均勻的小穗對其小花內(nèi)剩余花藥進(jìn)行統(tǒng)計，計算花藥伸出率；方法2：記錄視覺花藥伸出等級(0：沒有花藥伸出；1：1/3的花藥伸出；2：2/3的花藥伸出；3：花藥完全伸出)。以小麥花藥伸出率和視覺花藥伸出等級兩種性狀表型值共同評估花藥伸出特性。用Spass軟件將單環(huán)境的重復(fù)值求其平均值后，再進(jìn)行QTL分析。用W-test檢測親本表型間的差異顯著性。用IciMapping V4.2中的‘AOV’包計算花藥伸出特性的最佳線性無偏預(yù)測(best linear unbiased prediction,BLUP)、遺傳方差等。根據(jù)Song等的方法計算遺傳力，按照唐仕云等的方法計算遺傳變異系數(shù)。

1.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

用90K SNP芯片對102個株系進(jìn)行基因分型，用IciMapping V4.2中的BIN模塊進(jìn)行多態(tài)性分析并去除冗余標(biāo)記，篩選出兩親本間存在多態(tài)性的標(biāo)記，剔除偏分離標(biāo)記(<0.001)和缺失率>20%的標(biāo)記后，用IciMapping V4.2中的MAP模塊將剩余標(biāo)記進(jìn)行排序，并將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離(cM)，完成遺傳圖譜的構(gòu)建。

1.4 QTL的檢測

利用完備復(fù)合區(qū)間模型(ICIM)對4個環(huán)境下的表型值及BLUP值分別進(jìn)行QTL檢測。在α=0.05水平下進(jìn)行1 000次的排列檢驗(yàn)，確定LOD值的大小，采用正反逐步回歸法控制背景，步長設(shè)為1 cM。利用IciMapping V4.2中的MET模塊對多環(huán)境互作進(jìn)行QTL檢測。用Mapchart V2.2繪制QTL在染色體上的分布圖。通過中國春參考基因組(IWGSC RefSeq V1.0)對本研究所檢測到的QTL側(cè)翼標(biāo)記序列進(jìn)行比對，以獲取相應(yīng)標(biāo)記的物理位置，在中國春參考基因組(http://202.194.139.32/jbrowse- 1.12.3-release)中查詢前人已經(jīng)報道的標(biāo)記位置，確定本研究發(fā)現(xiàn)的QTL與前人報道的QTL是否一致。以“+染色體”和“+染色體”分別命名以花藥伸出率和視覺花藥伸出等級兩種方法定位到的QTL，以花藥伸出率和視覺花藥伸出等級兩種方法共同定位到的QTL用“+染色體”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

從表1可以看出，周8425B和小偃81的花藥伸出特性在不同環(huán)境下均存在顯著性差異，且RIL群體的表型數(shù)據(jù)呈現(xiàn)連續(xù)分布且存在超親分離現(xiàn)象。這表明花藥伸出特性是由多個基因控制的數(shù)量性狀。花藥伸出率和視覺花藥伸出等級的遺傳力分別為0.99和0.93，表明它們主要受遺傳因子影響，環(huán)境因素對其影響較小。

表1 親本及RIL群體花藥伸出特性的統(tǒng)計分析Table 1 Statistic analysis of anther elongation characteristics of parents and RIL population

2.2 遺傳圖譜構(gòu)建結(jié)果

小麥90K SNP芯片中的81 588個標(biāo)記通過篩選過濾后，剩余7 225個多態(tài)性標(biāo)記，劃分為 1 738個Bin標(biāo)記，這些標(biāo)記構(gòu)成的遺傳連鎖圖譜共包含28個連鎖群，覆蓋小麥21條染色體。圖譜全長為2 068.80 cM，平均圖距為1.19 cM，其中A基因組的長度最長，D基因組的長度最短。90K SNP芯片在小麥A、B、D基因組中的連鎖標(biāo)記數(shù)分別為740、832和166個(表2和圖1)。

2.3 花藥伸出特性的QTL定位結(jié)果

共檢測到8個控制花藥伸出特性的QTL(表3)，分別位于3A、3B、5B、6B、6D和7A染色體上，單個QTL可解釋3.49%～26.09%的表型變異。、和可在花藥伸出率和視覺花藥伸出等級調(diào)查中均被檢測到。其中，在花藥伸出率調(diào)查的E2和MET(環(huán)境互作)環(huán)境中被檢測到，在視覺花藥伸出等級調(diào)查的E4和MET環(huán)境中被檢測到，可解釋3.65%～10.48%的表型變異，為微效QTL，其加性效應(yīng)來自父本小偃81；在花藥伸出率調(diào)查的E1、E2和MET三個環(huán)境中被檢測到，在視覺花藥伸出等級調(diào)查的E1、E2、E3、E4和MET五個環(huán)境中被檢測到，可解釋8.12%～26.09%的表型變異，平均表型變異解釋率為17.00%，為穩(wěn)定表達(dá)的主效QTL，其加性效應(yīng)來自母本周8425B；在花藥伸出率調(diào)查的E4和MET環(huán)境中被檢測到，在視覺花藥伸出等級調(diào)查的E1和MET環(huán)境中均被檢測到，可解釋 3.49%～8.93%的表型變異，為微效QTL，其加性效應(yīng)來自母本周8425B。

圖1 花藥伸出特性QTL在染色體上的分布

表2 Bin標(biāo)記在不同染色體上的分布情況Table 2 Distribution of Bin markers on different chromosomes

另外，花藥伸出率QTL定位調(diào)查結(jié)果中，除、和外，也定位到、和，其中和在E3、E4和MET三個環(huán)境中均被檢測到，分別可解釋6.26%～16.98%和6.25%～15.02%的表型變異，其加性效應(yīng)分別來自父本小偃81和母本周8425B；在E4和MET環(huán)境中被檢測到，可解釋6.82%～11.71%的表型變異，其加性效應(yīng)來自母本周8425B。視覺花藥伸出等級QTL定位結(jié)果中，除、和外，也檢測到和，其中在E4和MET環(huán)境中被檢測到，可解釋3.99%～10.76%的表型變異；而在E4和MET環(huán)境中被檢測到，可解釋3.85%～9.55%的表型變異，這兩個QTL的加性效應(yīng)均來自母本周8425B。

表3 RIL群體花藥伸出特性的定位信息Table 3 Location information of anther elongationtraits in RIL population

3 討 論

在選擇作圖群體時，兩個親本之間表型差異的大小及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近不僅影響群體內(nèi)多態(tài)性標(biāo)記的數(shù)量，同時也與連鎖圖譜的標(biāo)記密度和QTL定位結(jié)果的準(zhǔn)確性密切相關(guān)。SNP標(biāo)記在染色體上分布均勻且數(shù)目眾多，其構(gòu)建的高密度連鎖圖譜有利于將QTL定位在較小的區(qū)間內(nèi)，極大地降低了候選基因預(yù)測的難度。本研究利用小麥90K基因芯片對包含102個家系的RIL群體及其親本進(jìn)行掃描分型，共篩選出1 738個Bin標(biāo)記，連鎖圖譜全長為2 068.8 cM，平均圖距為1.19 cM，并構(gòu)建了覆蓋小麥21條染色體的高密度遺傳圖譜。所構(gòu)建圖譜的Bin標(biāo)記在A染色體組有740個，B染色體組有832個，D染色體組有166個，D基因組的標(biāo)記數(shù)目比A、B染色體組少，這可能與六倍體小麥的來源及人工選擇有關(guān)。

本研究共定位到8個控制花藥伸出特性的QTL。其中位于6B染色體上的，與Muqaddasi等報道的位點(diǎn)側(cè)翼標(biāo)記位置接近，推測是同一QTL；位于3A染色體上的位于參考基因組727.399～729.691 Mb處，與Muqaddasi等報道的位點(diǎn)區(qū)間位置部分重疊，推測是同一QTL；位于6D染色體上的和、3B染色體上的、5B染色體上的以及7A染色體上的，與前人報道的QTL位置均不同，推測這些QTL均為新的控制花藥伸出特性的QTL。通過小麥花藥伸出率和視覺花藥伸出等級兩個性狀表型值共同評估花藥伸出特性，結(jié)果更加可靠。本研究通過這兩個性狀表型值進(jìn)行定位且在多個環(huán)境下穩(wěn)定表達(dá)的QTL有3個，分別為、和，這些QTL可為改良小麥品種的揚(yáng)花期相關(guān)性狀提供參考。