趙 欣，孟德義，蒼 晶，徐慶華，張 達

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

低溫作為一種常見的非生物脅迫因子，嚴重影響植物的生長發(fā)育和地理分布[1]。當環(huán)境溫度低于植物正常的承受范圍，會引起植物體內(nèi)生理代謝功能紊亂，嚴重時可導(dǎo)致植物死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，植物激素參與調(diào)節(jié)植物對低溫脅迫的響應(yīng)[3]。水楊酸(salicylic acid，SA)，化學(xué)名稱為鄰羥基苯甲酸，是一種天然酚類化合物，常作為重要的信號分子在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、種子萌發(fā)、抵御生物和非生物脅迫過程中起重要作用[4-5]。低溫脅迫下，擬南芥[6]、玉米[7]和小麥[8]等植物中內(nèi)源SA的含量顯著升高并伴隨著抗寒性增強。外源SA處理提高了低溫下香蕉[9]、菠菜[10]、檸檬[11]等植物體內(nèi)抗氧化物含量和抗氧化酶活性，清除活性氧(ROS)能力提高，緩解了低溫造成的氧化損傷。此外，外源SA還可以增加玉米的葉綠素和類胡蘿卜素等光合色素的含量，緩解低溫對幼苗生長的抑制，提高玉米抗寒性[12]?？梢?，SA在參與植物低溫脅迫應(yīng)答中扮演重要角色。

糖酵解(glycolysis，EMP)是高等植物體內(nèi)重要的一條呼吸代謝途徑，能夠為植物生長發(fā)育提供ATP、還原力和代謝物，與植物響應(yīng)低溫、干旱、鹽堿、重金屬等非生物脅迫密切相關(guān)[13]。己糖激酶(hexokinase,HxK)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)和丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PK)是EMP代謝途徑中的三個關(guān)鍵酶。低溫脅迫下植物的EMP代謝增強，HxK、PFK和PK活性升高，促進糖類物質(zhì)的分解與丙酮酸的積累，釋放大量能量以抵御低溫脅迫[14]。

研究表明，外源SA可促進植物在低溫下可溶性糖的積累，維持細胞內(nèi)外的滲透平衡[15]；通過調(diào)節(jié)糖代謝途徑相關(guān)酶基因的表達，提高植物的抗寒性[16]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，外源SA可提高低溫脅迫下冬小麥體內(nèi)蔗糖含量、蔗糖合成相關(guān)酶(蔗糖合成酶SuS和蔗糖磷酸合成酶SPS)活性及關(guān)鍵基因(TaSuS、TaSPS)的表達，降低了蔗糖分解代謝相關(guān)酶(可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶SAInv和堿性轉(zhuǎn)化酶A/N-Inv)活性及其基因(TaSAInv、TaA/N-Inv)的相對表達水平[17]。然而，外源SA對低溫脅迫下冬小麥EMP途徑的影響尚未見報道，SA是否影響EMP途徑中關(guān)鍵酶的活性及其基因表達量目前尚不清楚。本研究以強抗寒性冬小麥品種東農(nóng)冬麥1號和弱抗寒性冬小麥品種濟麥22號為試驗材料，探討外源SA對低溫脅迫下兩種冬小麥EMP代謝中果糖含量、丙酮酸含量和EMP關(guān)鍵酶(HxK、PFK和PK)活性及其相關(guān)基因(TaHxK、TaPFK和TaPK)相對表達量的影響，為進一步解析激素調(diào)控冬小麥抗寒性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冬小麥(TriticumaestivumL.)品種東農(nóng)冬麥1號(Dn1)和濟麥22號(Jm22)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥室提供。Dn1(強抗寒性小麥品種)在黑龍江地區(qū)保苗率達85 %以上，Jm22(弱抗寒性小麥品種)保苗率小于1%。

試驗材料于2019年9月10日在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗田播種，完全區(qū)組設(shè)計，行長2 m，行距0.2 m，播種深度55 cm，常規(guī)田間管理。于三葉期(2019年9月24日)對兩個冬小麥品種葉片噴施 1 mmol·L-1SA，以噴施等量的蒸餾水為對照。待大田自然降溫[18]連續(xù)10 d平均最低溫度為 5 ℃(2019年10月10日)、0 ℃(2019年10月29日)、-10 ℃(2019年11月25日)和 -25 ℃(2020年1月3日)時，選取長勢一致的麥苗，剪取葉片和分蘗節(jié)成0.5 cm的小段，液氮速凍， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 果糖、丙酮酸含量和EMP代謝關(guān)鍵酶活性的測定

果糖、丙酮酸含量測定和EMP代謝關(guān)鍵酶HxK、PFK和PK活性的測定參考劉麗杰[19]方法。

1.2.2 EMP重要酶基因表達量檢測

用Trizol法提取小麥葉片和分蘗節(jié)的總RNA，cDNA第一條鏈的合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金AT311，北京)說明。反應(yīng)體系20 μL，包括：1 μL RNA，1 μL Oligo(dT)，1 μL gRNA Remover，1 μL Transcript Enzyme Mix，6 μL Rnase-free Water，10 μL 2×Reaction Mix。反應(yīng)程序：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。使用Primer 6.0設(shè)計TaHxK、TaPFK和TaPK特異性引物，以小麥TaActin為內(nèi)參基因，引物見表1。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書(諾唯贊Q711，南京)反應(yīng)體系進行PCR。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性 10 s,60 ℃退火30 s,40個循環(huán)；95 ℃變性15 s， 60 ℃退火60 s，95 ℃變性15 s。采取2-△△Ct方法計算待測基因的相對表達量。3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used in quantitative real-time PCR analysis

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS 7.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源SA對冬小麥果糖含量的影響

隨著溫度的降低，兩個冬小麥品種葉片和分蘗節(jié)中果糖含量均呈先升后降的變化趨勢，且均在-10 ℃時達到峰值(圖1)。外源SA處理提高了低溫下兩個品種葉片和分蘗節(jié)中的果糖含量(-25 ℃下Jm22分蘗節(jié)除外)，Dn1葉片在0 ℃、-10 ℃和-25 ℃時SA處理果糖含量均顯著高于對照(圖1A)，分蘗節(jié)在-10 ℃時SA處理顯著高于對照(圖1C)；Jm22葉片和分蘗節(jié)的果糖含量均在-10 ℃時SA處理顯著高于對照(圖1B和D)。SA處理下冬小麥分蘗節(jié)中果糖含量高于葉片，且Dn1比Jm22積累了更多的果糖。

A:Dn1葉片；B:Jm22葉片；C:Dn1分蘗節(jié)；D:Jm22分蘗節(jié)。圖柱上不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 外源SA對低溫脅迫下冬小麥丙酮酸含量的影響

隨著溫度的降低，冬小麥葉片和分蘗節(jié)中丙酮酸含量均呈先升后降的變化趨勢，分別在 -10 ℃和0 ℃時達到峰值(Dn1的SA處理和Jm22對照中分蘗節(jié)呈升-降-升的趨勢，0 ℃時達到峰值)(圖2)。外源SA提高了Dn1分蘗節(jié)、-10 ℃和-25 ℃下Dn1葉片、0 ℃和-10 ℃下Jm22葉片和分蘗節(jié)中丙酮酸含量，且-25 ℃下的Dn1、0 ℃和 -10 ℃下Jm22分蘗節(jié)中SA處理顯著高于對照(圖2A和C、D)。外源SA處理對Dn1作用更明顯。

圖2 兩個冬小麥品種葉片和分蘗節(jié)中丙酮酸含量的變化

2.3 外源SA對低溫脅迫下冬小麥EMP代謝關(guān)鍵酶活性的影響

HxK、PFK、PK是EMP代謝的關(guān)鍵酶。隨著溫度的降低，兩個冬小麥品種葉片中HxK活性均先升后降，分別在-10 ℃和0 ℃時達到峰值(圖3A和B)；對照組中Dn1和Jm22分蘗節(jié)中HxK活性呈逐漸升高和升-降-升的趨勢，均在-25 ℃達到峰值(圖3C和D)。外源SA處理顯著提高了0 ℃和-10 ℃時Dn1葉片、5 ℃和 -10 ℃時Dn1分蘗節(jié)中HxK活性(圖3A 和C)，也顯著提高了0 ℃和-10 ℃時Jm22葉片和分蘗節(jié)中HxK活性(圖3B和D)。SA處理 下Dn1葉片和分蘗節(jié)中HxK活性總體高于Jm22。

圖3 兩個冬小麥品種葉片和分蘗節(jié)中HxK活性的變化

隨著溫度的降低，兩個品種葉片和分蘗節(jié)中PFK活性均呈先升后降的變化趨勢(除對照組Dn1葉片中PFK活性呈逐漸升高的趨勢)，外源SA處理下，Dn1和Jm22葉片和分蘗節(jié)中PFK活性分別在-10 ℃(圖4A和C)和0 ℃達到峰值(圖4B和D)。外源SA處理顯著提高了冬小麥葉片和分蘗節(jié)在0 ℃和-10 ℃時PFK活性。SA處理后，Dn1分蘗節(jié)中PFK活性高于Jm22。

圖4 兩個冬小麥品種葉片和分蘗節(jié)中PFK活性的變化

隨著溫度的降低，兩個品種葉片和分蘗節(jié)中PK活性均先升后降(除對照組Jm22葉片中PK活性呈升-降-升的趨勢)(圖5)。外源SA處理后，Dn1葉片中PK活性在-10 ℃達到峰值(圖5A)；而Dn1分蘗節(jié)和Jm22葉片和分蘗節(jié)中PK活性均在0 ℃達到峰值(圖5B～圖5D)。外源SA處理顯著提高了0 ℃和-10 ℃時Dn1葉片(圖5A)及0 ℃時Dn1分蘗節(jié)(圖5C)中PK活性，顯著降低了-25 ℃時Jm22葉片(圖5B)和 0 ℃時Jm22分蘗節(jié)中PK活性(圖5D)。外源SA對Dn1葉片和分蘗節(jié)中PK活性影響大于Jm22，且兩個品種葉片中PK活性高于分蘗節(jié)。

圖5 兩個冬小麥品種葉片和分蘗節(jié)中PK活性的變化

2.4 外源SA對低溫脅迫下冬小麥EMP途徑關(guān)鍵酶基因表達量變化的影響

隨著溫度的降低，兩個冬小麥品種葉片和分蘗節(jié)中TaHxK的相對表達量均呈先升后降的變化趨勢，Dn1葉片和分蘗節(jié)及Jm22葉片中TaHxK的表達量均在-10 ℃達到峰值，Jm22分蘗節(jié)在0 ℃達到峰值(圖6A和圖6B)。外源SA處理顯著提高了0 ℃和-10 ℃時Dn1葉片和分蘗節(jié)中TaHxK的相對表達量，顯著提高了 -10 ℃和-25 ℃時Jm22葉片、-10 ℃時Jm22分蘗節(jié)中TaHxK的相對表達量。

隨著溫度的降低，兩個品種葉片和分蘗節(jié)中TaPFK相對表達量也表現(xiàn)出先升后降的變化趨勢，葉片中TaPFK表達量均在-10 ℃時達到峰值；而對照分蘗節(jié)中TaPFK的相對表達量在 0 ℃達到峰值，SA處理分蘗節(jié)中在-10 ℃達到峰值。外源SA處理顯著提高-10 ℃時Dn1葉片(圖6C)、0 ℃及以下低溫Dn1分蘗節(jié)、-10 ℃時Jm22分蘗節(jié)中TaPFK的相對表達量(圖6D)。

隨著溫度的降低，兩個品種葉片和分蘗節(jié)中TaPK相對表達量也表現(xiàn)出先升后降的趨勢，均在-10 ℃達到峰值(除SA處理下Jm22分蘗節(jié)在0 ℃達到峰值)(圖6E和圖6F)。外源SA處理顯著提高了-10 ℃時Dn1葉片、0 ℃及以下低溫Dn1分蘗節(jié)、0 ℃時Jm22分蘗節(jié)中TaPK的相對表達量。

圖A、C、E為兩種冬小麥葉片；圖B、D、F為兩種冬小麥分蘗節(jié)。同一品種圖柱上不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

糖作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境條件下可為植物提供能量和碳源[20]。低溫脅迫下，植物通過積累大量可溶性糖提高其滲透調(diào)節(jié)能力并維持生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，從而提高抗寒性[21]。植物激素SA可與ABA、ROS、Ca2+等信號途徑相互作用，共同激活抗氧化物、脫水蛋白、抗凍蛋白和病程相關(guān)蛋白等物質(zhì)的積累，改善低溫對植物造成的傷害[22]。研究表明，外源SA處理通過促進植物可溶性糖的積累提高抗寒性[16,23-24]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，外源SA可以促進低溫脅迫下Dn1蔗糖含量的積累[17]。果糖作為一種重要的可溶性糖，是蔗糖水解的產(chǎn)物，可通過磷酸化作用進入EMP和三羧酸循環(huán)(TCA)，在抵御外界脅迫中發(fā)揮重要作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫提高了Dn1和Jm22葉片和分蘗節(jié)中的果糖含量，且強抗寒性品種Dn1比弱抗寒性品種Jm22積累了更多的果糖；外源SA顯著提高了兩個冬小麥品種葉片和分蘗節(jié)中果糖含量，表明SA影響了低溫脅迫下的糖代謝，這與前人的研究結(jié)果一致[17,23-24]。丙酮酸是EMP途徑的最終產(chǎn)物，作為有機酸的重要前體，不僅參與呼吸氧化供能，還與糖代謝、脂肪代謝和TCA等多種關(guān)鍵代謝途徑密切相關(guān)[26]。本研究中，丙酮酸含量變化與果糖含量變化趨勢相似，低溫脅迫下兩個冬小麥品種丙酮酸含量的積累表現(xiàn)出分蘗節(jié)早于葉片達到峰值，說明分蘗節(jié)首先啟動了防御機制，這與分蘗節(jié)作為Dn1越冬的主要器官有關(guān)。外源SA顯著提高了-25 ℃時Dn1分蘗節(jié)中丙酮酸的含量，這可能為TCA提供了足夠的原料，產(chǎn)生更多的ATP供能。

植物在逆境下需要消耗大量的能量來提高抗性[27]，而能量的產(chǎn)生主要通過EMP途徑。HxK、PFK和PK是EMP途徑中的最重要的三個限速酶。在植物體內(nèi)，HxK可催化多種六碳糖代謝，其中果糖可作為其代謝底物；PFK可將6-磷酸果糖磷酸化形成1，6-二磷酸果糖；丙酮酸是PK的產(chǎn)物。前人研究發(fā)現(xiàn)，外源SA通過調(diào)節(jié)可溶性糖含量和糖代謝途徑中相關(guān)酶活性影響EMP、TCA和PPP等途徑的呼吸強度，延緩果實衰老，延長果實在低溫下的貯藏時間[28]。HxK和PFK是和果糖關(guān)系最密切的兩種酶。本研究發(fā)現(xiàn)，外源SA提高了Dn1和Jm22中HxK和PFK活性，且分別在-10 ℃和0 ℃時達到峰值。說明在-10 ℃和0 ℃時冬小麥體內(nèi)果糖磷酸化的能力最強。有研究指出，非生物脅迫下低水平的HxK活性可以抑制植物衰老，從而提高植物的耐冷性[29-30]，這可能與冬小麥葉片HxK活性在-10 ℃以后下降有關(guān)。高活性的PFK可以將更多的果糖分解為中間代謝產(chǎn)物，為下一步反應(yīng)提供充足的底物，從而產(chǎn)生更多的能量，有利于冬小麥應(yīng)對低溫脅迫。外源SA處理下Dn1中PFK活性均高于Jm22，表明SA顯著提高了Dn1在低溫脅迫下的能量代謝水平。PK是催化EMP代謝的最后一步反應(yīng)，其產(chǎn)物丙酮酸是生物體多種循環(huán)代謝的底物。已有的研究表明，外源腐胺處理提高了PK和丙酮酸羧化酶的活性，為TCA提供足夠的草酰乙酸和丙酮酸，促進了更多ATP的釋放[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，SA處理顯著提高了Dn1葉片和分蘗節(jié)中PK的活性，顯著降低了 -25 ℃時Jm22葉片和分蘗節(jié)中PK的活性，導(dǎo)致-25 ℃時丙酮酸產(chǎn)量降低，不能為TCA提供足夠的原料，這可能是Jm22抗寒性弱、不能順利越冬(返青率低)的主要原因。

董文科等[14]發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可以提高EMP途徑中關(guān)鍵酶基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，外源SA處理顯著提高了低溫脅迫下冬小麥葉片和分蘗節(jié)中TaHxK和TaPFK基因的表達量，且對Dn1的作用比Jm22更明顯。推測SA通過調(diào)節(jié)TaHxK和TaPFK基因的表達量來影響這兩種酶的活性，從而提高果糖的代謝水平，利于植株維持較高的呼吸代謝。SA處理后，低溫脅迫下Dn1中TaPK表達量顯著上調(diào)，而在Jm22中TaPK下調(diào)表達(0 ℃分蘗節(jié)除外)，說明SA通過影響基因的表達水平改變相關(guān)酶的活性，而基因表達和酶活的不一致，可能由于酶活性的改變不僅發(fā)生在mRNA水平，也受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞代謝的影響。

綜上可見，外源SA處理顯著提高了Dn1葉片和分蘗節(jié)中果糖含量、丙酮酸含量，提高了EMP代謝中HxK、PFK和PK的活性和相關(guān)酶基因(TaHxK、TaPFK、TaPK)的表達，這有助于產(chǎn)生更多的有機酸和初級代謝產(chǎn)物，促進呼吸代謝和線粒體電子傳遞，從而提高Dn1的抗寒性；與Dn1相比，Jm22的EMP代謝相關(guān)酶活性及酶基因的表達水平顯著低于Dn1，EMP代謝受到了嚴重的阻遏，不能充分利用前期積累的糖類也不能產(chǎn)生足夠的代謝中間物質(zhì)，導(dǎo)致無法產(chǎn)生足夠的越冬所需的能量和小分子物質(zhì)，這可能也是Jm22無法順利越冬的原因之一。由此我們得出結(jié)論：外源SA可以通過改善冬小麥的EMP代謝途徑提高其抗寒性。