錢 成， 汪 波， 費雪蓮， 殷潘成， 黃波濤， 邢海波*, 胡曉鈞*

1. 上海應用技術大學化學與環(huán)境工程學院， 上海 201418

2. 上海市環(huán)境科學研究院， 上海 200333

引 言

最初， 三聚氰胺(Mel)是作為一種工業(yè)化合物使用的。 由于三聚氰胺含氮量很高， 達到66%， 因此被不法商販非法添加到動物飼料和原料奶中， 假冒增加蛋白質(zhì)的含量[1-3]。 三聚氰胺是環(huán)丙氨嗪的一種降解產(chǎn)物[4]， 高劑量的三聚氰胺可導致腎結石和腎衰竭[5]。 環(huán)丙氨嗪(Cyr)是一種三嗪類昆蟲生長抑制劑， 廣泛應用于畜禽業(yè)中控制蒼蠅和蛆[6]。 環(huán)丙氨嗪的過度使用會導致動物源食品污染， 產(chǎn)生一系列潛在的環(huán)境問題， 并且通過食物鏈的富集作用危害人類健康[7]。 已有研究證實它能引起小鼠乳腺腫瘤[8]。 因為， 動物源食品在進入市場前必須按照國家標準對環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的殘留進行檢測， 所以如何現(xiàn)場檢測環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺的殘留已成為動物源性食品和原料奶生產(chǎn)的熱點問題[9-11]。 美國FDA將在動物源食品中環(huán)丙氨嗪的最大殘留限量(MRLs)設定為0.05～0.5 μg·kg-1； 中國規(guī)定原料奶中三聚氰胺的安全限量為2.5 mg·L-1。

電子集成電路系統(tǒng)由基本邏輯開關組成， 它們能夠通過接收表示真(1， 高電壓)或假(0， 低電壓)值的布爾輸入并產(chǎn)生適當?shù)牟紶栞敵鰜韴?zhí)行布爾邏輯。 分子邏輯開關使用邏輯開關概念構建生物傳感器， 為檢測問題提供了一種可能的解決方案[12]。 根據(jù)值和輸入之間的關系， 可以獲得廣泛的邏輯函數(shù)， 包括非門(NOT gate), 與門(AND gate), 或門(OR gate), 或非門(NOR gate), 抑制門(INHIBIT gate)等。 在過去的幾十年里， 基于超分子復合物和小分子、 酶生化網(wǎng)絡[13]、 生物聚合物-配體和光子相互作用[14]和其他系統(tǒng)的各種分子邏輯開關已經(jīng)被設計出來。 這些光和電信號形式的邏輯開關是對特殊輸入刺激的響應。 比色信號的邏輯開關成本低、 速度快， 尤其是能通過肉眼識別， 這些特點使它的應用范圍非常廣泛。 在全新的研究中表明， 基于金納米粒子的高消光系數(shù)和強距離依賴性光學特性的均勻比色檢測方法變得越來越有吸引力[15-16]。

核酸適配體能夠以高親和力和靶標特異性結合[17]， 已被廣泛用作生物傳感器[18]構建中的識別元件[19-21]。 在以往研究中， 曾利用胸腺嘧啶和氨基之間的氫鍵， 設計了一系列適配體修飾的納米金探針， 用來檢測牛奶中的三聚氰胺或環(huán)丙氨嗪[22-23]。

采用金納米粒子設計邏輯開關， 一般需要用有機配位劑對金納米粒子進行修飾。 Du等設計了一種含有三聚氰胺和Hg2+的游離金納米粒子的比色邏輯開關[24]。 Huang等采用谷胱甘肽、 金屬離子和乙二胺四乙酸控制金納米粒子分散和聚集的裝置， 開發(fā)了系列簡單的邏輯開關[25]。 此外， 有研究人員基于金納米粒子的分散和聚集狀態(tài)， 設計了三個輸入信號的比色邏輯開關， 用于檢測三聚氰胺、 半胱氨酸和Hg2+[26]。 上述方法只為三聚氰胺檢測設計了一個邏輯開關[24, 26]。 而Huang等盡管設計了三個邏輯開關， 但是開關之間沒有直接的邏輯關系， 只是簡單的羅列了三個邏輯開關形式[25]。 本研究基于三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪的適配體， 借助納米金設計了兩個與門邏輯開關， 將待測溶液分別通過兩種邏輯開關， 可以檢測出牛奶中三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪的含量。 通過設計雙與門邏輯開關組， 首次開發(fā)出同時檢測三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪的快速檢測邏輯開關組， 可以用于現(xiàn)場同時檢測牛奶中的三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪。

1 實驗部分

1.1 儀器

實驗所需所有儀器如表1。

表1 實驗儀器

1.2 試劑

核酸適配體序列如下：

Tcy1 5’-GGTTGGTTGGTTGGTT-3’(16 bp)，

T31

5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(31 bp)。

上述核酸適配體由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

氯金酸、 檸檬酸三鈉、 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、 氨苯胺、 氨苯胺、 苯胺、 L-酪氨酸、 三聚氰酸、 L-賴氨酸、 L-鹽酸賴氨酸、 環(huán)丙氨嗪、 三聚氰胺等均為分析純。 所有試劑和緩沖溶液均用超純水(電阻率18 MΩ·cm)配置， 實驗中所用原料奶采購自光明乳業(yè)的一個原料奶廠， 具體見表2。

表2 實驗試劑

1.3 樣品

在10 mL離心管中向1.0 mL原料奶樣品中加入5 mL 1%乙酸， 混合均勻后在室溫下孵育5 min。 樣品以10 000 r·min-1的速度離心10 min， 將上清液與白色不透明沉淀分離后， 取上清液。 用2.0 mol·L-1氫氧化鈉溶液將pH值調(diào)節(jié)至8.0。 用純水稀釋至最終溶液體積。

1.4 檢測三聚氰胺的與門邏輯開關(AND logic gate 1)

在AND邏輯開關1中， 當兩個輸入都為“true”時， 輸出為“true”。 否則， 輸出為“false”。 將表面包裹了T31的AuNPs (0.24 mM)溶液加入到試管中。 邏輯開關是通過不同組合和順序的輸入來實現(xiàn): (1) H2O (0， 0)； (2) 0.5 mg·L-1環(huán)丙氨嗪(1， 0)； (3) 1.8 μmol·L-1CTAB (0， 1)； (4) 0.5 mg·L-1環(huán)丙氨嗪+1.8 μmol·L-1CTAB (1， 1)。

1.5 檢測環(huán)丙氨嗪的與門邏輯開關(AND logic gate 2)

在AND邏輯開關2中， 當兩個輸入都為“true”時， 輸出為“true”。 否則， 輸出為“false”。 將表面包裹了Tcy1的AuNPs (0.24 mmol·L-1)溶膠加入到試管中。 邏輯開關是通過不同組合和順序的輸入來實現(xiàn)的: (1) H2O (0， 0)； (2) 0.5 mg·L-1環(huán)丙氨嗪(1， 0)； (3) 1.8 μmol·L-1CTAB (0， 1)； (4) 0.5 mg·L-1環(huán)丙氨嗪+1.8 μmol·L-1CTAB (1， 1)。

2 結果與討論

2.1 檢測三聚氰胺的AND邏輯開關1

為了檢測溶液中是否含有三聚氰胺， 首先設計了AND邏輯開關1， 將適配體T31包裹在納米金表面， 并使用T31和三聚氰胺作為兩個輸入[27]。 單鏈核酸適配體T31可以通過分子間作用力和疏水作用結合在納米金表面， 也可以通過電荷作用和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)相結合， 保護納米金在高濃度的電解質(zhì)中不被聚集[22]。 在體系沒有三聚氰胺的情況下， AuNPs在T31的保護中不會聚集和改變顏色。 當體系中存在三聚氰胺時， T31可以通過氫鍵與三聚氰胺結合。 T31與三聚氰胺的特異性遠強于環(huán)丙氨嗪或其他含氨基類化合物[20]， 因此三聚氰胺的加入會特異性結合T31， 使AuNPs失去保護， 在CTAB的作用下產(chǎn)生聚集。 因此可以用肉眼觀察到溶液的顏色從紅色變?yōu)樗{色[圖1(a)]。

如圖1(b)所示， 三聚氰胺、 T31作為邏輯開關的信號輸入， 它們的存在與否被定義為“0”和“1”[圖1(b)]。 當A650/A526比值≥0.4時， 把輸出值定義為“1”。 當比值<0.4時， 把輸出值定義為“0”[圖1(d)]。 當溶液中含有T31時， 只有溶液中存在三聚氰胺的情況下， 溶液顏色才會從紅色變?yōu)樗{色， 樣品的吸收曲線可直接反映出此變化。 當溶液顏色由紅變藍時， 納米金526 nm吸光度顯著降低， 而650 nm處吸光度顯著增大[圖1(c)]。 因此， AND邏輯開關1可以用檢測體系中是否含有三聚氰氨， 而用A650/A526的比值代替單一吸光度度值作為信號輸出可以更敏銳地反映信號變化。 因此， AND邏輯開關1可以用于檢測體系中是否含有三聚氰胺。 當T31輸入值為“1”， 且輸出值為“1”時， 表示溶液中肯定含有三聚氰胺。 可以僅通過肉眼就判斷溶液中是否有三聚氰胺[圖1(c)]并且通過AND邏輯開關1的標準曲線來檢測牛奶中三聚氰胺的濃度。

圖1 AND 邏輯開關1的設計

AND邏輯開關1的輸出情況可以通過透射電子顯微鏡直觀地證明。 如圖2所示， 在不含Mel和CTAB的情況下， AuNPs分散良好如圖2(a)。 在只含有三聚氰胺的情況下， 包裹在納米金表面的和游離的T31與三聚氰胺通過氫鍵結合， 因此， AuNPs仍然處于分散狀態(tài)， 如圖2(b)。 當體系中只有CTAB時， T31一部分通過分子間作用力包裹在AuNPs表面， 另一部分會通過電荷作用與CTAB形成復合物， 保護AuNPs不被聚集， 如圖2(c)。 在三聚氰胺和CTAB同時存在的情況下， Mel可以通過氫鍵和T31相結合， AuNPs失去保護， 在CTAB的作用下聚集[如圖2(d)]。

2.1.1 檢測體系pH的優(yōu)化

三聚氰胺的水溶液呈弱堿性， pH值為8.0， 因此溶液pH會影響三聚氰胺的溶解度。 當然， pH值也會影響納米粒子的表面電荷。 經(jīng)過簡單的預處理， 用HCl和NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值， 以找到AND邏輯開關1的最佳pH值。 在強堿性的條件下(pH>12.0)， 三聚氰胺會失去所有的氨基而轉(zhuǎn)化為氰尿酸， 不會與適配體T31結合， CTAB無法正常聚集AuNPs， 如圖3(b)所示， 吸收率比值(A650/A526)非常低。 在強酸性條件中(pH<2.0)， 吸收率比值(A650/A526)變得高得多， 這是因為納米粒子的表面電荷被破壞了。 在pH 8.0時， 吸光度比值是在pH 4.0～13.0范圍內(nèi)的最大值， 因此選擇pH 8.0作為檢測介質(zhì)的最佳pH值。

圖2 AND邏輯開關1的透射電子顯微鏡(TEM)圖像

2.1.2 AND邏輯開關1中適配體(T31)濃度的優(yōu)化

在AND邏輯開關1中， 核酸適配體T31會通過疏水作用包裹在納米金表面， 并通過電荷作用保護納米金顆粒。 太高或太低的適配體濃度都會影響到體系的檢測結果。 圖3(a)顯示了當0～36 nmol·L-1之間不同濃度的T31被加入到AuNPs溶液中時的顏色變化。 其中高濃度的三聚氰胺的濃度為0.50 mg·L-1， 較低濃度的為0.25 mg·L-1。 如圖3(b)所示， 當T31的濃度大于18 nmol·L-1時，A650/A526的比值不再降低， 并趨于穩(wěn)定。 這意味著T31的濃度足以保護所有的AuNPs顆粒不被聚集， 而過多的T31會導致浪費。 因此， 選擇18 nmol·L-1的適配體濃度進行后續(xù)的研究。

2.1.3 AND邏輯開關1的響應時間

時間在AND邏輯開關1中起著重要的作用， 作為一種快速檢測方法， 在滿足檢測要求的條件下， 方法全過程所需時間越少越好。 因此研究了不同反應時間的A650/A526比值。 如圖3(c)所示， 三聚氰胺濃度越高， 650 nm處的吸光度值增加越明顯。 首先， 隨著時間的延長， 吸收度比值明顯增加。 而反應5 min后， 該比值達到穩(wěn)定值， 因為所有的AuNPs都已經(jīng)聚集。 在三聚氰胺存在的情況下， 環(huán)丙氨嗪的加入會使顏色變化更加明顯。 這些結果表明， 反應時間選擇5 min足矣。

2.1.4 反應溫度的優(yōu)化

該檢測體系對溫度也比較敏感， 過高的溫度會影響適配體的活性。 因此研究了不同濃度的三聚氰胺在不同溫度下的吸光度比值。 如圖3(d)所示， 由于核酸適配體的DNA活性，A650/A526的比值在50 ℃時最高。 但所設計的邏輯開關通常用于室溫下的現(xiàn)場測試， 而20 ℃下的比值足以進行檢測。 因此我們選擇常溫(20 ℃)作為現(xiàn)場試驗的最佳選擇。

圖3 (a)pH值對檢測三聚氰胺的影響; (b)適配體濃度對三聚氰胺檢測的影響; (c)響應時間; (d)溫度的優(yōu)化

2.1.5 AND邏輯開關1的靈敏度

為了證明AND邏輯開關1可以用于檢測牛奶中的三聚氰胺， 向原料牛奶中添加了不同量的三聚氰胺。 再向溶液中加入18 nmol·L-1T31， 并使T31的輸入為“1”。 經(jīng)過預處理后， 每個樣品在526和650 nm測量三次。 如圖4所示， 當三聚氰胺和適配體T31特異性結合后， AuNPs就失去了保護產(chǎn)生聚集， 與此同時溶液顏色由紅色變?yōu)樗{色， 而AND邏輯開關1的輸出由三聚氰胺濃度決定(“1”，A650/A526>0.4； “0”，A650/A526<0.4)。 根據(jù)溶液顏色的變化， 選擇三聚氰胺濃度為0～0.5 mg·L-1， 記錄下吸光度比值， 并擬合標準曲線。 吸光度比值與三聚氰胺濃度呈線性相關， 相關系數(shù)為0.997， 曲線擬合方程為y=0.809 9x+0.13。 通過3σ/斜率得到該傳感器的檢測限(LOD)為85 μg·L-1。 當三聚氰胺的濃度大于0.24 mg·L-1時， 此時A650/A526的比值大于0.4， 這意味著輸出值為“1”， 也可以通過肉眼看到溶液顏色從紅色變?yōu)樗{色。 這個濃度遠遠低于2.5 mg·L-1(美國FDA和歐盟規(guī)定了牛奶中三聚氰胺的最大殘留限量)[22]。

圖4 生物傳感器檢測三聚氰胺的靈敏度

2.1.6 用AND邏輯開關1檢測牛奶樣品中的三聚氰胺

在樣品預處理之前， 在牛奶中加入不同含量的三聚氰胺， 濃度分別為0.200 0， 0.500 0和1.000 mg·L-1。 通過AND邏輯開關1， 每個樣品重復檢測3次， 同時用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)法分析同樣的牛奶樣品3次。 分析結果如表1所示， AND邏輯開關1的回收率在95%～105%之間。 這表明AND邏輯開關1可以用于牛奶中三聚氰胺的快速檢測。

2.2 檢測環(huán)丙氨嗪的AND邏輯開關2

納米金的顏色變化反映了金納米粒子在懸浮液中的聚集狀態(tài)[28]， 這種聚集是通過電解質(zhì)所誘導產(chǎn)生的[29]。 由三聚氰胺或環(huán)丙氨嗪引起的AuNPs的聚集不穩(wěn)定， 容易受到干擾。 由于Tcy1可以包裹在AuNPs表面， 也可以通過電荷作用與十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)相結合， 保護AuNPs在高濃度CTAB或其他強電解質(zhì)中不聚集。 根據(jù)以上原理， 將環(huán)丙氨嗪的適配體Tcy1包裹在納米金表面， 并以環(huán)丙氨嗪和CTAB為輸入構建了AND邏輯開關2[圖5(a)]。 與AND邏輯開關1類似， CTAB作為一種帶正電荷的強電解質(zhì)， 根據(jù)環(huán)丙氨嗪的輸入值， 產(chǎn)生不同的作用。 在體系沒有環(huán)丙氨嗪的情況下， Tcy1可以通過分子間作用力和疏水力與AuNPs結合， 也可以與CTAB結合形成復雜的結構， 因此AuNPs在Tcy1的保護下不會聚集和改變顏色。 當環(huán)丙氨嗪加入到體系中時， 胸腺嘧啶和環(huán)丙氨嗪的氨基可以形成氫鍵， 因此富含鳥嘌呤的Tcy1和環(huán)丙氨嗪可以形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結構， 因而Tcy1就不再保護AuNPs， AuNPs就會在CTAB的作用下產(chǎn)生聚集， 因此可以通過比色測定法檢測到溶液顏色從紅色到藍色的明顯變化。

表3 應用AND邏輯開關1和HPLC-MS技術檢測牛奶樣品中的三聚氰胺

如圖5(b)所示， 環(huán)丙氨嗪和CTAB存在與否被定義為輸入值“0”和“1”。 當A650/A526比值大于0.4時， 輸出值定義為“1”， 否則定義為“0”[圖5(d)]。 只有當環(huán)丙氨嗪和CTAB同時存在的情況下， 顏色才會從紅色變?yōu)樗{色， 這與AND邏輯開關的功能一致[30]， 不僅可以通過吸光度體現(xiàn)溶液顏色改變， 而且可以僅從肉眼判斷溶液中是否有環(huán)丙氨嗪[圖5(c)]， 因此AND邏輯開關2可以用于檢測環(huán)丙氨嗪的濃度。

AND邏輯開關2的輸出可以通過透射電子顯微鏡直觀地證明。 如圖6所示， Tcy1導致AuNPs的粒徑大小增加了一點， 因為適體通過分子間作用力和疏水作用包裹在AuNPs表面但包裹后的AuNPs依然是分散狀態(tài)[圖6(a)]。 當環(huán)丙氨嗪加入到體系中時， Tcy1和環(huán)丙氨嗪結合并形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結構， 見圖6(b)。 當體系中只有CTAB時， 一部分圍繞在納米粒子周圍的Tcy1會通過電荷作用與CTAB形成復合物[圖6(c)]。 當環(huán)丙氨嗪和CTAB加入體系中時， Tcy1與環(huán)丙氨嗪形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結構， 而失去保護的AuNPs被CTAB聚集[圖6(d)]。

2.2.1 AND邏輯開關2中適配體(Tcy 1)濃度的優(yōu)化

在AND邏輯開關2， 部分適配體會通過分子間作用力和疏水作用包裹在AuNPS表面， 其余適配體也會和CTAB通過電荷作用結合。 圖7(a)顯示了當在AuNPs溶液中加入0～36 nmol·L-1的Tcy1時的顏色變化。 其中高濃度的環(huán)丙氨嗪的濃度為0.50 mg·L-1， 低濃度為0.25 mg·L-1。 如圖7(a)所示， 當Tcy1的濃度大于15 nmol·L-1時，A650/A526的比值低于0.4， 與值“0”一致。 因此， 當Tcy 1的濃度大于15 nmol·L-1時， 可以保護AuNPs不聚集， 而Tcy 1過多會造成浪費和過度保護， 推后CTAB對AuNPs的聚集作用。 為了避免AuNPs的聚集反應來得太晚， 選擇了15 nmol·L-1的適配體濃度來進行后續(xù)研究。

圖5 AND邏輯開關2的設計和制造

圖6 AND邏輯開關2的透射電子顯微鏡(TEM)圖像

2.2.2 AND邏輯開關2中CTAB濃度的優(yōu)化

CTAB的濃度對AND邏輯開關2的性能至關重要。 因此將0.3～3.0 μmol·L-1濃度的CTAB加入到15 nmol·L-1Tcy1的AuNPs溶液中， 分別與0.25和0.50 mg·L-1的環(huán)丙氨嗪相互作用6分鐘。 圖7(b)說明當CTAB濃度從0.30增加到1.50 μmol·L-1時， 含0.25 mg·L-1環(huán)丙氨嗪的溶液的顏色與含0.50 mg·L-1環(huán)丙氨嗪的溶液顏色變化一致，A650/A526兩個比值都在逐漸增加。 因此1.50 μmol·L-1的CTAB適用于高、 低濃度環(huán)丙氨嗪的檢測。

2.2.3 AND邏輯開關2的響應時間

時間在AND邏輯開關2中起著重要的作用。 作為一種快速檢測方法， 在滿足檢測要求的條件下， 方法全過程所需時間越少越好， 因此研究了不同反應時間的A650/A526比值。 如圖7(c)所示， 環(huán)丙氨嗪濃度越高， 納米粒子聚集越快， 650 nm的吸光度增加越明顯。 分析認為不斷增加的環(huán)丙氨嗪可以與適配體特異性結合， 更多的AuNPs會暴露在CTAB下。 在最初的6 min內(nèi)， 吸光度比值隨著時間的延長而明顯增加。 6 min后， 游離的AuNPs差不多全部都聚集， 因此吸光度比值緩慢增加并很快達到平衡。 聚集反應完全， 溶液顏色在接下來的幾個小時內(nèi)不會改變。 因此， 6 min的反應時間足以檢測體系完全反應， 實驗選擇6 min作為體系的最適反應時間。

圖7 (a) 適配體濃度對環(huán)丙氨嗪檢測的影響， 適配體的濃度為0～36 nmol·L-1； (b)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)濃度對環(huán)丙氨嗪檢測的影響， CTAB濃度為0.6～3.0 μmol·L-1； (c)時間對環(huán)丙氨嗪檢測的影響， 時間0～16 min Fig.7 (a) The effect of aptamer concentration on cyromazine detection, the concentrations of aptamer were from 0 to 36 nmol·L-1; (b) The effect of the CTAB concentration on cyromazine detection, the concentrations of CTAB were from 0.6 to 3.0 μmol·L-1; (c) The effect of the time on cyromazine detection, the time were from 0 to 16 min

2.2.4 環(huán)丙氨嗪檢測的AND邏輯開關2的靈敏度和選擇性

為了證明AND邏輯開關2是否可以用于牛奶中環(huán)丙氨嗪的檢測， 在牛奶中加入了不同含量的環(huán)丙氨嗪。 在包裹了適配體的AuNPs中加入了1.5 μmol·L-1的CTAB， 使CTAB的輸入為“1”。 經(jīng)過預處理后， 在526和650 nm波長下檢測每個樣品的吸光度比值三次。 結果如圖8所示， 當環(huán)丙氨嗪-Tcy1的G-四聯(lián)體形成時， AuNPs失去了Tcy1的保護， 發(fā)生聚集， 同時溶液顏色由紅色變?yōu)樗{色。 因此AND邏輯開關的輸出由環(huán)丙氨嗪濃度決定(“1”，A650/A526>0.4； “0”，A650/A526<0.4)。 根據(jù)溶液顏色的變化， 測定0～2.0 mg·L-1環(huán)丙氨嗪的吸光度比值， 并繪制標準曲線。 吸光度比值與0.10～0.50 mg·L-1濃度的環(huán)丙氨嗪之間存在線性相關性， 擬合方程為y=0.231+0.993x， 相關系數(shù)為0.991。 根據(jù)該方程， 當環(huán)丙氨嗪濃度大于0.17 mg·L-1時，A650/A526的比值大于0.4， 此時輸出值為“1”。 根據(jù)3σ/斜率計算出該傳感器的檢測限(LOD)為9.0 μg·L-1， 這個值遠遠低于2.5 mg·L-1(美國FDA和歐盟規(guī)定了牛奶中滅蠅胺的最大殘留限量)。

圖8 環(huán)丙氨嗪生物傳感器的靈敏度

為了檢查信號值的假陽性， 采用其他常用獸藥和結構類似物來驗證AND邏輯開關2的選擇性。 對照實驗組使用了環(huán)丙氨嗪、 三聚氰胺、 三聚氰酸、 苯胺、 L-酪氨酸、 氰尿酸、 L-賴氨酸、 L-鹽酸賴氨酸。 實驗結果如圖9所示， 在對照實驗中沒有明顯的顏色變化， 除了環(huán)丙氨嗪外， 其他八種化合物的輸出結果都是“0”。 這表明， 這些化合物在使用AND邏輯開關2檢測牛奶中環(huán)丙氨嗪時， 對檢測體系的干擾可以忽略。

2.2.5 用AND邏輯開關2檢測牛奶樣品中的環(huán)丙氨嗪

樣品預處理之前， 向牛奶中加入不同含量的環(huán)丙氨嗪， 濃度分別為0.200 0， 0.300 0， 0.500 0和1.000 mg·L-1。 通過AND邏輯開關2， 每個樣品重復檢測3次， 同時用高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)法分析同樣的牛奶樣品3次。 如表4所示， AND邏輯開關2的回收率在95%～115%之間。 分析結果表明， 該方法可用來檢測牛奶中的環(huán)丙氨嗪。

圖9 環(huán)丙氨嗪檢測方法相對于其他獸藥濃度的選擇性: 環(huán)丙氨嗪、 三聚氰胺、 三聚氰酸、 苯胺、 L-酪氨酸、 氰尿酸、 L-賴氨酸、 L-鹽酸賴氨酸(500 μg·L-1)， Tcy1的濃度為15 nmol·L-1

表4 應用AND邏輯開關和HPLC-MS技術檢測牛奶樣品中的環(huán)丙氨嗪

3 結 論

通過使用適配體、 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、 三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪來控制金納米粒子的聚集和分散， 設計了一個雙與門邏輯開關組(AND 邏輯開關 1， AND 邏輯開關 2)用來檢測牛奶中的三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪。 首次利用適配體修飾的AuNPs， 設計出了邏輯開關組， 用來同時檢測環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺。 這兩個邏輯開關快速、 簡便， 可用于現(xiàn)場檢測中， 顏色變化可以通過肉眼觀察。 相信構建這一雙與門邏輯開關組的過程可以對其他分析物的檢測提供幫助。