曾 臻，周碧盈，豐 艷，陸馨敏，楊彩娟，盧藝玲，羅家英，譚強來，吳蘭蘭*

（1.廈門醫(yī)學院 海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學院 天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023）

牡蠣味美肉細、藥食同源，在《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等中醫(yī)藥典籍中早有記載。由于牡蠣兼具鮮美的食用價值和較高的藥用價值，因此牡蠣也名列原衛(wèi)生部公布的第一批《既是食品又是藥品的物品名單》。隨著現(xiàn)代先進科學理念及高新加工技術的引入，牡蠣功效成分及其生理活性研究越來越受到關注。研究表明，牡蠣中含有豐富的多糖、多肽、牛磺酸等活性成分，呈現(xiàn)出抗疲勞、抗氧化、增強免疫力等多種生理功能[1]。其中，牡蠣多糖的開發(fā)利用已經(jīng)成為目前藥品、保健食品等相關產(chǎn)業(yè)的熱門方向之一。如ZHONG 等[2]研究表明低分子量牡蠣多糖可緩解腫瘤細胞介導的對骨髓源性樹突狀細胞功能的高干度抑制，具有體內(nèi)抗腫瘤活性。CAI 等[3]研究了牡蠣多糖對5-氟尿嘧啶治療的S180荷瘤小鼠的腸道黏膜炎及代謝的改善作用。

牡蠣種群較多，在我國分布廣泛，如福建牡蠣（Crassostrea angulata）、太平洋牡蠣（C.gigas）、香港牡蠣（C.hongkongensis）、近江牡蠣（C.ariakensis）、熊本牡蠣（C.sikmea）、日本牡蠣（C.nippona）等。福建牡蠣的產(chǎn)量最高，是福建、浙江、廣東東部等地區(qū)的主要養(yǎng)殖品種。據(jù)統(tǒng)計，2018 年福建牡蠣的產(chǎn)量2.12×106t，其中福建省產(chǎn)1.89×106t，分別占比全國牡蠣總產(chǎn)量41.20%和36.85%[4-5]。不同種群的牡蠣的多糖含量及結(jié)構或存在一定差異。研究表明，太平洋牡蠣多糖分子量為1 299 kDa，是以葡萄糖1 種單糖組成的D-吡喃型葡聚糖[6]。楊大俏等[7]分離純化得到3 種近江牡蠣多糖，其單糖組成及分子量大小均不一致，分別為9 種單糖組成的1.24×105Da、6 種單糖組成的6.7×104Da、3 種單糖組成的8.3×103Da。然而，福建牡蠣的多糖含量及結(jié)構等研究并未見詳細報道。

如要有效開發(fā)利用牡蠣多糖，其大量提取制備是首先要解決的第一步。牡蠣多糖提取方法多樣，如水提醇沉法[8]、酶解提取法[9]、熱堿提取法[10]等。利用不同的方法、不同的介質(zhì)、不同的參數(shù)進行牡蠣多糖提取，其提取效率并不相同[11]。如侯麗等[8]通過水提醇沉法獲得牡蠣多糖粗品，以干基計的提取率為15.39%，純度為81.23%。楊大俏等[9]采用酶解提取法近江牡蠣粗多糖，以干基計的提取率為21.29%，純度為85.18%。因此，本研究依托大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目，采用三種簡易方法分別提取福建牡蠣的粗多糖，進而測定含量以對比及分析效果，以期了解較適合采用的福建牡蠣多糖的提取制備方法，為有效開發(fā)利用福建牡蠣多糖提供數(shù)據(jù)參考，也為福建牡蠣精深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展給予一定助力。

1 試驗部分

1.1 試劑

福建牡蠣（福建省廈門市集美區(qū)灌口鎮(zhèn)菜市場，個體重量在3.8～14.0 g 之間，經(jīng)流水洗凈后，開殼收集牡蠣全組織備用）；葡萄糖、氫氧化鉀、無水乙醇、冰乙酸等常規(guī)試劑（國藥集團化學試劑有限公司）；堿性蛋白酶、胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器

UV-5200 紫外可見分光光度計（元析，上海）；DK-S26電熱恒溫水浴鍋（精宏，上海）；DHG-9023A 恒溫鼓風干燥箱（一恒，上海）；PHS-3C 型pH 計（儀電，上海）；HiPette 手動移液器（大龍，北京）；T25 高速分散機（I KA，德國）；myPlate 磁力攪拌器（IKA，德國）；Vortex 3 漩渦混勻器（IKA，德國）；3K15 低溫高速離心機（Sigma，德國）；KA92NV02TI 冰箱（Siemens，德國）；Quintix5102 電子天平（Sartorius，德國）。

1.3 福建牡蠣多糖的提取方法

1.3.1 水提醇沉法

參考并適當修改侯麗等[8]的水提醇沉法對福建牡蠣多糖進行簡易提取。方法簡述如下：準確稱取100 g福建牡蠣全組織，加入300 g 去離子水，利用高速分散機充分勻漿備用；從中準確稱取200 g，加入200 mL 95%乙醇，室溫磁力攪拌2 h，6×103r/min 離心15 min收集沉淀，再加入200 g 去離子水，于90℃恒溫水浴中浸提2 h，流水冷卻后同上離心收集上清，重復浸濾后合并，調(diào)節(jié)pH 值至4.6，同上離心收集上清，加入無水乙醇至終濃度為70%，同上離心收集沉淀后干燥，獲得牡蠣多糖粗提物，稱重并測算粗得率。

1.3.2 酶解提取法

參考并適當修改楊大俏等[7，9]的酶解提取法對福建牡蠣多糖進行簡易提取。方法簡述如下：準確稱取100 g 福建牡蠣全組織，利用高速分散機勻漿10 min，加入150 g 去離子水，再次混勻后置于55℃恒溫水浴0.5 h，調(diào)節(jié)pH 值至8.0，添加0.8%的復合酶（堿性蛋白酶：胰蛋白酶=3∶1），繼續(xù)恒溫水浴酶解2 h，隨后煮沸滅酶，1×104r/min 離心10 min 收集上清，調(diào)節(jié)pH值至7.0，采用0.22 μm 濾膜過濾除雜后干燥，獲得牡蠣多糖粗提物，稱重并測算粗得率。

1.3.3 熱堿提取法

參考并適當修改陳騫等[10]的酶解提取法對福建牡蠣多糖進行簡易提取。方法簡述如下：準確稱取100 g福建牡蠣全組織，加入100 g 去離子水，利用高速分散機充分勻漿，加入100 mL 30%的氫氧化鉀溶液，沸熱1 h，冷卻后加入150 mL 95%乙醇，過濾收集沉淀，再次溶解至100 g 去離子水，利用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0，再次過濾收集上清，加入等體積的95%乙醇后干燥，獲得牡蠣多糖粗提物，稱重并測算粗得率。

1.4 福建牡蠣多糖的含量測定方法

選用苯酚-硫酸法。方法簡述如下：配制100 μg/mL的葡萄糖標準使用溶液，分別精密吸取0、80、160、240、320 μL 于10 mL 塑料離心管中，用去離子水分別補足至400 μL 后，每管各加入6%苯酚溶液200 μL，輕晃搖勻，再快速垂直加入濃硫酸1 mL，渦旋混勻，反應20 min 后冷卻至室溫，測定490 nm 波長處吸光度，利用EXCEL 繪制標準曲線（橫坐標：葡萄糖質(zhì)量，縱坐標：吸光度），獲得擬合曲線及其方程。上述三種方法提取制備的福建牡蠣多糖樣品經(jīng)適當稀釋一定倍數(shù)后，同樣方法準確移取400 μL，按上述步驟，測定吸光度值，根據(jù)標準曲線換算出相應含量，并計算福建牡蠣多糖的純度。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

如無特別標注，實驗平行測定三次，采用WPS Office 2019 Excel 及GraphPad Prism version 5.01 進行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制，數(shù)據(jù)表示為均值±標準偏差（m±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種方法提取制備福建牡蠣多糖的粗得率對比

三種方法提取制備福建牡蠣多糖的粗得率對比如圖1 所示。由圖1 可知，以濕重計，水提醇沉法提取制備福建牡蠣多糖的粗得率（%）為1.25±0.21，酶解提取法的得率（%）為0.68±0.09，熱堿提取法的粗得率（%）為0.98±0.18。表明采用水提醇沉法提取制備的粗得率較高。在此基礎上，進一步采用苯酚-硫酸法測定其中福建牡蠣多糖的含量。

圖1 三種方法測定福建牡蠣多糖含量的粗得率對比圖

2.2 苯酚-硫酸法的標準曲線的線性擬合分析

苯酚-硫酸法的標準曲線如圖2 所示，通過對數(shù)據(jù)進行線性回歸，得到含量C-吸光度A 的擬合方程：y=0.0099x+0.1012，相關系數(shù)R2為0.9998。表明該標準曲線的線性擬合度合格，可用于后續(xù)福建牡蠣多糖的含量測定。

圖2 苯酚-硫酸法的標準曲線圖

2.3 三種方法提取制備福建牡蠣多糖的純度對比

三種方法提取制備福建牡蠣多糖的純度對比如圖3 所示。由圖3 可知，水提醇沉法提取制備福建牡蠣多糖的純度（%）為33.68±5.76，酶解提取法的純度（%）為64.73±4.47，熱堿提取法的純度（%）為33.09±2.55。表明采用酶解提取法提取制備福建牡蠣多糖的純度較高。

圖3 三種方法測定福建牡蠣多糖含量的純度對比圖

3 結(jié)束語

福建省是我國最大的牡蠣養(yǎng)殖省份，據(jù)測算，2017年福建省牡蠣產(chǎn)量178.81 萬t，占全國牡蠣總產(chǎn)量37%，產(chǎn)值56 億元人民幣[12]。雖然福建省牡蠣養(yǎng)殖規(guī)模大、產(chǎn)量高，但絕大多數(shù)用作鮮食和冷凍、干制等傳統(tǒng)加工產(chǎn)品，產(chǎn)品附加值較低，急需融入現(xiàn)代食品加工高新技術進行精深加工和高附加值化利用。然而，相比其他牡蠣種群，福建牡蠣研究主要集中在品種選育及相關基因功能等方面，如對福建牡蠣3β-HSD[13]、SMRP1[14]、17β-HSD[15]等基因克隆及表達，以及對福建牡蠣選育群體的遺傳多樣性[16]、數(shù)量性狀[17]、營養(yǎng)成分差異[18]等，而對多糖等食藥相關成分的分析較為薄弱。

本研究對比三種簡易常用方法提取制備福建牡蠣粗多糖的效果，研究結(jié)果表明采用水提醇沉法提取制備的得率較高，且操作較為簡便（圖1）。高蒙蒙等[6]依次采用室溫水提、60℃水提和稀堿提取太平洋牡蠣多糖，發(fā)現(xiàn)常溫水提得法的率最高。胡玲玲等[19]發(fā)現(xiàn)采用水提醇沉法提取枸杞多糖步驟簡單、得率較高。王靜等[20]也發(fā)現(xiàn)水提醇沉法工藝方便可靠、簡單經(jīng)濟，適用于山慈菇多糖的提取。此外，研究結(jié)果表明采用酶解提取法提取制備福建牡蠣多糖的純度較高（圖3）。任壯[21]探究了利用酶解的方式以優(yōu)化提取海帶多糖。張瑞娟等[22]對比測試了6 種蛋白酶對皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai）內(nèi)臟進行酶解提取多糖的效果，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的效果最好。因此，本研究結(jié)果可為有效開發(fā)利用福建牡蠣多糖提供數(shù)據(jù)參考，也為福建牡蠣精深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展給予一定助力。