陳莉，羅穎，范俊

(湖北科技學院 藥學院,湖北咸寧 437100)

天胡荽為傘形科天胡荽屬植物，多生長在濕潤的草地、河溝邊、林下等，海拔475～3 000 m[1]。天胡荽具有清熱解毒、利尿消腫的功效[2]。內服可治療咽喉炎、急性腎炎、小便不利、急性黃疸型肝炎等，外敷可用于帶狀皰疹、濕疹、腳癬、癰疽疔瘡、丹毒等[3]。

天胡荽中化學成分主要為黃酮苷、揮發(fā)油、香豆精、氨基酸類等[4-5],具有抗病毒、肝損傷保護、抗腫瘤等多種藥理活性[6]。該植物中的山奈酚（kaempferol）與槲皮素（quercetin）具有較強的抗氧化、抗炎、抗增殖性質和免疫調節(jié)等作用[7-8]。本文建立了一種測定天胡荽中槲皮素與山奈酚含量的高效液相色譜法，為天胡荽的質量研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC300高效液相色譜系統(tǒng)，北京清博華科技有限公司；BP211D電子天平（精度0.1 mg），德國賽多利斯公司。

1.2 試劑

槲皮素，HPLC＞98.0%，北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；山萘酚，93.8%，中國食品藥品檢定研究院；乙腈與甲醇，色譜純，美國Thermo Fisher公司；蒸餾水，深圳屈臣氏蒸餾水有限公司。天胡荽采自湖北省通城縣，經鑒定為傘形科天胡荽亞科植物天胡荽的全草。

1.3 實驗方法

1.3.1 混合對照品溶液的制備

取槲皮素與山奈酚適量，用甲醇溶解，制得含槲皮素100.3 μg/mL，山奈酚100.5 μg/mL的混合對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取天胡荽藥材粉末（約0.5 g），置50 mL圓底瓶中，加入20 mL溶劑（甲醇與25%鹽酸體積比為4∶1），記錄總重量，置于80 ℃的水浴中加熱回流1.0 h，待冷卻后用分析天平稱量總重量，加入上述溶劑以補充損失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）和0.40%磷酸（B）為流動相進行梯度洗脫：0～ 5 min，30%A；5～ 20 min，30% ～ 50%A；20～25 min，30%A；柱溫30.0 ℃；檢測波長368 nm；進樣量20 μL。此條件下天胡荽供試品中各組分峰形較好，共存成分不干擾槲皮素與山奈酚的檢測。所得HPLC色譜圖見圖1。

圖1 實驗條件下標準品與樣品色譜圖

1.3.4 方法學考察

（1）線性關系考察。移取1.3.1項下混合對照品溶液0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL和5.00 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，混勻，按1.3.3項下色譜條件進樣測定。以峰面積（A）為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，建立標準曲線。

（2）加樣回收實驗。取9份已知含量天胡荽藥材粉末（批號為20200502）約0.25 g，精密稱定后置于圓底瓶中，分別加入1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL混合對照品溶液，按1.3.2項下方法制備供試品溶液，再按1.3.3項下色譜條件進樣測定并計算回收率。

（3）精密度實驗。將1.3.2項下配置的供試品溶液，按1.3.3項下色譜條件重復進樣6次，記錄色譜峰面積。

（4）穩(wěn)定性實驗。將供試品溶液于常溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h后進樣測定，記錄色譜峰面積。

（5）樣品含量測定。將采摘的天胡荽藥材陰干后打粉，干燥至恒重。按1.3.2項下方法制備得供試品溶液，按1.3.3項下色譜條件進樣測定，計算樣品中槲皮素與山奈酚的含量。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

HPLC檢測天胡荽中槲皮素與山奈酚的線性關系為：槲皮素A=169.16C-460.30，r=0.999 7；山奈酚A=136.20C-291.14，r=0.999 6。結果表明，在濃度分別為2.51～50.15 μg/mL和2.51～50.25 μg/mL時，槲皮素與山奈酚線性關系良好。

2.2 加樣回收實驗

天胡荽中槲皮素與山奈酚的加樣回收實驗結果見表1、表2。槲皮素的加樣回收率RSD值為1.60%（n=9），山奈酚的加樣回收率RSD值為1.97%（n=9），表明方法準確度良好。

表1 槲皮素回收率實驗結果（n=9）

表2 山奈酚回收率實驗結果（n=9）

2.3 精密度實驗

槲皮素的質量含量測定結果依次為0.051 9%、0.051 2%、0.052 9%、0.052 3%、0.051 9%和0.052 7%，RSD=1.19%（n=6）；山奈酚的質量含量測定結果依次為0.095 6%、0.096 7%、0.095 4%、0.094 6%、0.097 2%和0.097 6%，RSD=1.21%（n=6），方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

穩(wěn)定性實驗中，天胡荽中槲皮素的質量含量測定結果0.051 9%、0.052 1%、0.051 2%、0.051 8%、0.050 9%和0.050 4%，RSD=1.29%（n=6）；山奈酚的質量含量測定結果依次為0.095 6%、0.097 2、0.095 2%、0.096 4%、0.094 1%和0.093 6%，RSD=1.43%（n=6）。實驗結果表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 樣品含量測定

天胡荽中槲皮素與山奈酚的含量測定結果見表2。表中兩批天胡荽樣品均采自同一地方，但采集時間不同，放置時間不同，測定結果差異較大。

表2 天胡荽中槲皮素與山奈酚的質量含量（n=3）

2.6 討論

（1）預實驗研究中，比較了乙腈-水和乙腈-磷酸水溶液為流動相的色譜分離情況，發(fā)現(xiàn)在流動相中添加磷酸可改善峰形；比較了等度洗脫和梯度洗脫，綜合考慮出峰時間與分離效果，采用2.1項下梯度洗脫方式；檢測出未知成分（11.7 min），樣品中槲皮素峰（13.7 min）與該未知成分可較好分離，峰形與出峰時間均較佳。

（2）掃描槲皮素、山奈酚對照品溶液的紫外光譜，在270 nm、368 nm均有吸收，其中270 nm吸收相對較強，但在368 nm處測定含量時干擾少，色譜基線更穩(wěn)定，因此選用368 nm作為檢測波長。

（3）本試驗天胡荽分別于2020年4月初和5月初采自湖北省通城縣。因藥材受產地、采收時間、貯存時間長短等因素影響，含量差異較大，其具體情況還有待進一步研究。

3 結論

建立了測定天胡荽中槲皮素和山柰酚含量的HPLC方法。結果表明，槲皮素和山柰酚與天胡荽中其他成分分離良好；在2.51～50.15 μg/mL和2.51～50.25 μg/mL時，兩種成分的濃度與峰面積線性關系良好；平均加樣回收率分別為99.7%（RSD=1.60%）和100.3%（RSD=1.97%）。該方法簡便、準確，適用于天胡荽中槲皮素和山柰酚的含量測定。