何偉，于淼，彭超，袁愷，朱威宇，丁子元，江俊杰，周衛(wèi)強(qiáng)*

（1.中糧生物科技（北京）有限公司，北京 102209；2.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；3.北京百奧茵諾生物科技有限公司，北京 102209）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬于真菌門、多孔菌 目、靈芝菌科、靈芝屬，是一種大型藥用真菌，最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。由于靈芝能預(yù)防或治療多種疾病，在古代曾被稱為“仙草”[2]?！侗静菥V目》中記載，靈芝可分為赤芝、黑芝、青芝、白芝、黃芝和紫芝等，其中赤芝和紫芝在2000年被《中華人民共和國藥典》首次收錄，具有“補(bǔ)氣安神，止咳平喘”的功能[3]。近年來，中國、東南亞國家及美國等地的許多學(xué)者對靈芝進(jìn)行了深入研究，研究結(jié)果表明靈芝中含有如多糖、三萜、甾醇、核酸、蛋白質(zhì)、多肽和脂肪酸等活性物質(zhì)，其中靈芝多糖和靈芝三萜類這兩類物質(zhì)含量占比最高，同時也是靈芝具有藥效的主要成分[4]。

靈芝液體深層發(fā)酵是通過將靈芝真菌接種至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，使得靈芝在液體培養(yǎng)基中生長，并代謝合成一些生物活性成分，如多糖、靈芝酸等物質(zhì)[5-6]?，F(xiàn)代研究表明靈芝發(fā)酵液中富含多糖、靈芝酸等生物活性成分，常被用于保健品、化妝品領(lǐng)域[7-8]。

靈芝中藥雙向發(fā)酵技術(shù)是指以藥用真菌靈芝菌為發(fā)酵菌株，將含有一定活性成分中藥材作為發(fā)酵基質(zhì)[9]。中藥既能提供真菌生長所需營養(yǎng)，又能受到真菌中酶的作用改變中藥自身成分，從而使整個發(fā)酵作用具有雙向性[10]。在靈芝培養(yǎng)過程中，添加適量的中藥材，如黃芪、山藥、當(dāng)歸和薏米仁等，可以提高靈芝發(fā)酵的水平，從而促進(jìn)靈芝發(fā)酵積累多種多量的生物活性物質(zhì)[11-12]。眾多研究表明，靈芝菌作為雙向發(fā)酵菌種具有很強(qiáng)的優(yōu)越性，以中藥提取物、中藥粉末或中藥殘渣為基質(zhì)，以靈芝為發(fā)酵菌株進(jìn)行組合發(fā)酵，能改變發(fā)酵體系中活性成分的含量和組成[13-14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝菌，保藏號：CICC14020、CICC14023。

玉米粉、淀粉，中糧生物科技股份有限公司；黃芪、當(dāng)歸、山藥以及薏米仁，亳州市佗藥堂藥業(yè)有限公司；土豆粉，食品級，浙江中好邢食品添加劑有限公司。

葡萄糖，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉、蛋白胨、棉子蛋白胨、大豆蛋白胨以及酵母膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MaSO4·7H2O、K2HPO4，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T&J Btype型發(fā)酵罐，迪必爾生物工程（上海）有限公司；HZQ-F160型振蕩培養(yǎng)箱，常州杰博森儀器有限公司；IMH100-SSS型恒溫培養(yǎng)箱，美國ThermoFisher Scientific；SCB-1360超級潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HWS28水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；X3R離心機(jī)，美國ThermoFisher Scientific；UV-1750紫外分光光度計，日本島津；SX-700高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 固體培養(yǎng)基

采用土豆粉作為營養(yǎng)物質(zhì)，制備PDA固體平板培養(yǎng)基。

1.3.2 種子液培養(yǎng)基

葡萄糖35 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L以及維生素B10.1 g/L。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

（1）發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖35 g/L、酵母粉5 g/L、蛋白胨5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、七水硫酸鎂1.0 g/L以及維生素B10.1 g/L。

（2）碳源篩選所用培養(yǎng)基。碳源以同等碳元素計分別選擇葡萄糖、玉米粉液化液、玉米淀粉液化液以及玉米淀粉糖化液。

（3）氮源篩選所用培養(yǎng)基。氮源以同等氮元素計分別選擇蛋白胨、酵母粉、蛋白胨和酵母粉復(fù)配、大豆蛋白胨、棉子蛋白胨以及酵母膏。

（4）碳氮比篩選所用培養(yǎng)基。固定碳元素含量，通過變化培養(yǎng)基中氮元素含量調(diào)整不同碳氮比，3種碳氮質(zhì)量比分別為 15、 30和40。

（5）發(fā)酵條件優(yōu)化所用培養(yǎng)基。葡萄糖35 g/L、酵母粉2.5 g/L、蛋白胨2.5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、七水硫酸鎂1.0 g/L以及維生素B10.1 g/L。

（6）中藥培養(yǎng)基。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基上分別添加黃芪、山藥、當(dāng)歸或薏米仁各10 g/L。

1.4 靈芝菌種培養(yǎng)

1.4.1 平板菌種培養(yǎng)

取出保藏的菌種，在試管或平板上挑取一小塊帶有菌絲的瓊脂放在新的培養(yǎng)基上，并在平板上標(biāo)明接種日期和菌種編號放在（28±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)7 d左右。

1.4.2 種子液培養(yǎng)

從平板上挑取1 cm×1 cm大小的菌塊，接種到搖瓶培養(yǎng)基中并加入配好的維生素B1溶液。將接種好的三角瓶放在28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)7 d左右，得到成熟的種子液。

1.5 靈芝發(fā)酵工藝流程

靈芝發(fā)酵工藝流程圖如圖1所示。

圖1 發(fā)酵工藝流程圖

1.6 靈芝多糖檢測

1.6.1 靈芝多糖的提取

采用乙醇溶劑對靈芝多糖進(jìn)行提取[15]。

1.6.2 檢測方法

采用硫酸-苯酚法進(jìn)行顯色反應(yīng)對靈芝多糖進(jìn)行檢測，以無水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.233 3x-0.000 6，其中y表示吸光度，x表示靈芝多糖含量（g/L），R2=0.999 5。

1.7 靈芝酸檢測

1.7.1 靈芝三萜的提取

提取溶劑為正丁醇、料液比為1∶3（v∶v）、超聲溫度為50 ℃、超聲時間為40 min及超聲功率為120 W[17]。

1.7.2 檢測方法

采用香草醛-冰醋酸顯色反應(yīng)對靈芝酸進(jìn)行檢測，以齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.910 2x-0.022 2，其中y表示吸光度，x表示靈芝酸含量（g/L），R2=0.999 6。

1.8 生物量檢測

取發(fā)酵液樣品35 mL與50 mL于離心管內(nèi)，8 000 r/min離心10 min，倒去上清液，加入純水充分混勻后再離心棄去上清液，重復(fù)此步驟2次，得到濕菌體，再將其放入80 ℃烘箱中烘24 h，對干菌體進(jìn)行稱重。

2 結(jié)果分析

2.1 不同碳源對靈芝發(fā)酵的影響

如表1所示，葡萄糖作為碳源時，干重含量最少，而玉米粉液化液作為碳源時，干重含量最高，這是因為玉米粉液化液中含有玉米粉顆粒，有利于靈芝菌絲的吸附生長，從而使得靈芝菌生長條件更好；淀粉液化液和淀粉糖化液的區(qū)別在于，糖化液中的還原糖占比高于液化液中的還原糖占比，在干重方面兩者的影響差別不大；與單一的葡萄糖作為碳源相比，淀粉作為碳源時會促進(jìn)靈芝菌體的生長。

表1 不同碳源對靈芝發(fā)酵的影響

從靈芝多糖含量的對比來看，玉米粉液化液作為碳源時，靈芝多糖含量相對較高；與葡萄糖相比，淀粉液化液作為碳源時，靈芝多糖含量相對較低。淀粉液化液與葡萄糖作為碳源，淀粉液化液中除含有葡萄糖外，還含有未被分解的二糖、三糖、糊精等物質(zhì)，這些物質(zhì)在靈芝生長過程中不被或者較難被利用，使得淀粉液化液作為碳源進(jìn)行發(fā)酵的效果亞于葡萄糖作為碳源；相比淀粉，玉米粉液化后還具有多種微量元素，而這些微量元素可促進(jìn)靈芝多糖的合成。

從靈芝酸整體來看，玉米粉液化液作為碳源時，靈芝酸含量最高；而以淀粉液化液和淀粉糖化液作為碳源時靈芝酸含量與葡萄糖作為碳源時的靈芝酸含量相近。

2.2 不同氮源對靈芝發(fā)酵的影響

如圖2所示，從靈芝多糖含量來看，以酵母粉作為對照氮源，其中蛋白胨、棉子蛋白胨、大豆蛋白胨作為替代氮源與酵母粉的作用效果無明顯差別；但酵母粉和蛋白胨復(fù)配后氮源與酵母粉相比，其對靈芝多糖的積累有促進(jìn)作用；酵母膏作為氮源時不利于靈芝多糖的合成。

圖2 不同氮源對靈芝發(fā)酵的影響

從靈芝酸含量來看，以酵母粉作為對照氮源，其中蛋白胨、酵母粉蛋白胨復(fù)合氮源、酵母膏、棉子蛋白胨以及大豆蛋白胨對靈芝酸都有促進(jìn)作用，尤其是大豆蛋白胨作為氮源時對靈芝酸的積累促進(jìn)作用更大。

2.3 不同碳氮比對靈芝發(fā)酵影響

如圖3、4所示，從多糖指標(biāo)出發(fā)，兩株靈芝菌都表現(xiàn)出碳氮比太高或太低都會出現(xiàn)多糖含量少的情況；從干重來分析，都表現(xiàn)出隨碳氮比的增加干重含量也減少的趨勢?？赡苁且驗楫?dāng)碳氮比太高時，氮源含量較少，不足以提供靈芝生長的營養(yǎng)需求，導(dǎo)致靈芝菌體生長受限，從而導(dǎo)致菌體生物量和靈芝多糖的合成都會減少；當(dāng)碳氮比太低時，碳源含量一定的情況下，氮源含量較多，對靈芝發(fā)酵營養(yǎng)過剩，導(dǎo)致靈芝一直處于生長旺盛期，干重較高，相對之下靈芝多糖的合成減少。

圖3 不同碳氮比對終點(diǎn)多糖影響

圖4 不同碳氮比對終點(diǎn)干重影響

2.4 不同溶氧條件對靈芝發(fā)酵影響

發(fā)酵終點(diǎn)各參數(shù)數(shù)據(jù)如表2所示，從整體發(fā)酵周期來看，溶氧條件的變化對靈芝發(fā)酵周期影響很大，溶氧控制在20%時相對于不控制溶氧（對照）條件，發(fā)酵周期縮短67.5 h；對于靈芝多糖的影響，控制溶氧在10%以上時相對對照靈芝多糖含量有所增加，尤其是溶氧控制在20%時，靈芝多糖含量達(dá)到2.185 g/L，相比對照增加了0.818 g/L。通過生物量的變化可以發(fā)現(xiàn)，溶氧條件對靈芝菌體的生長影響很大，尤其是在溶氧條件不足的情況下，例如4#不控溶氧條件下，其菌體干重含量最少，而靈芝菌作為一種好氧真菌在缺氧的情況下會使其生長代謝受到影響，導(dǎo)致生長受限；從靈芝酸的變化來看，溶氧條件的變化對于靈芝酸的含量影響不大。

表2 發(fā)酵終點(diǎn)各參數(shù)

如圖5所示，從靈芝多糖的變化趨勢上來看，對照和控制溶氧條件對比，溶氧在10%以上時其多糖的變化趨勢基本在同時間點(diǎn)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折，而不控溶氧條件下的多糖變化在前期變化緩慢，到發(fā)酵中后期才有積累的趨勢；幾個溶氧條件下，溶氧控制在20%左右時其靈芝多糖積累最多。

圖5 不同溶氧條件下靈芝多糖變化趨勢

2.5 不同中藥成分對靈芝發(fā)酵的影響

2.5.1 不同中藥成分對靈芝多糖含量的影響

如圖6所示，分別添加黃芪、當(dāng)歸、山藥以及薏米仁4種中藥各10 g/L與對照進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)黃芪、山藥、當(dāng)歸和薏米仁這幾種中藥對靈芝多糖的積累都有促進(jìn)作用，尤其是黃芪作為中藥基質(zhì)添加到培養(yǎng)基中對靈芝多糖的促進(jìn)效果更明顯，使得靈芝多糖達(dá)到7.914 g/L，相比對照增加3.445 g/L。

圖6 不同中藥成分對靈芝多糖含量的影響

2.5.2 不同中藥成分對靈芝酸含量的影響

如圖7所示，黃芪、當(dāng)歸、山藥以及薏米仁幾種中藥的添加對靈芝酸的積累都具有促進(jìn)作用，尤其是黃芪的添加對其作用效果更為明顯。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加10 g/L的黃芪可以促進(jìn)靈芝酸的積累，使靈芝酸含量達(dá)到0.28 g/L，同比對照增加0.16 g/L，而其他3種中藥對于靈芝酸的促進(jìn)作用較小。

圖7 不同中藥對靈芝酸的影響

3 結(jié)論

上述實驗結(jié)果表明，通過對靈芝發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化，得到酵母粉和蛋白胨復(fù)配作為氮源有利于靈芝多糖和靈芝酸的積累；玉米粉、葡萄糖作為碳源有利于靈芝多糖和靈芝酸的積累；通過碳氮比優(yōu)化實驗確定了C∶N（質(zhì)量比）為30時更有利于靈芝發(fā)酵；發(fā)酵過程中，溶氧條件控制在20%左右時有利于靈芝發(fā)酵指標(biāo)的增長；添加中藥物質(zhì)黃芪、當(dāng)歸、山藥或薏米仁對于靈芝發(fā)酵都有促進(jìn)作用，其中添加黃芪的發(fā)酵液中，靈芝多糖和靈芝酸含量都相對較高，而當(dāng)歸、山藥、薏米仁3種中藥相對于黃芪對靈芝多糖和靈芝酸的促進(jìn)作用相對較弱。本文主要研究了靈芝多糖和靈芝酸的生產(chǎn)方法，為靈芝產(chǎn)物在生產(chǎn)中提供幫助；同時中藥物質(zhì)的添加，能促進(jìn)靈芝中活性成分的增加，大大推動了靈芝發(fā)酵液在保健品和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。希望通過本文研究，為“中藥雙向發(fā)酵技術(shù)”的開發(fā)提供幫助。