郎超

（山西藥科職業(yè)學院，山西太原 030031）

黃芩，又名山茶根，是唇形科黃芩屬多年生草本植物，主要分布于我國東北地區(qū)和內蒙古自治區(qū)中東部，味苦而寒，清熱、抗病毒、消炎和抗氧化等作用顯著[1-3]。黃芩藥材中含有黃芩苷、黃芩素等多種有效提取物成分。近年來的報道稱，黃芩苷除了具有傳統抗炎、抗氧化、抗病毒等功效外，還具有較為廣泛的抗癌活性[4-6]。本研究選用黃芩苷處理人肝癌細胞HepG2，通過MTT實驗檢測黃芩苷對腫瘤細胞存活的影響，并使用細胞流式檢測、Western Blot實驗和實時定量PCR實驗，對黃芩苷誘導腫瘤細胞凋亡的促進效應做了初步的探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

黃芩苷（baicalin），95%，溶于DMSO，上海源葉生物科技有限公司；Caspase3、Bcl-2、Bax等抗體試劑，上海碧云天生物技術有限公司；Trizol-RNA提取試劑、q-RTPCR實驗相關試劑盒，日本TAKARA公司；DMEM培養(yǎng)基，生工生物工程（上海）股份有限公司；penicillin-streptomycin，日本同仁公司；細胞凋亡檢測試劑盒，前塵生物科技有限公司；引物由Invitrogen（上海）合成。

Galaxy 170 S二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Eppendorf公司；MX2型微孔板振蕩器，韓國FINEPCR公司；Infinite F50型酶標儀，瑞士Tecan公司；TG-16型離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BD FACSCalliburⅡ型流式細胞儀，美國BD公司；PowerPac HC型電泳儀、CFX Connect型熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

MCF-7（人類乳腺癌上皮細胞株）于DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入10% FBS及1% penicillin-streptomycin，培養(yǎng)條件：5% CO2、37 ℃、55%濕度。

1.3 MTT實驗

選取適量處于對數生長期的HepG2細胞，接種在96孔板中，細胞充分貼壁后，分別加入200 μL含20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L黃芩苷的培養(yǎng)基，每組5個復孔，對照為PBS，在5% CO2、37 ℃、55%濕度條件下培養(yǎng)24 h后取出；更換100 μL新鮮培養(yǎng)基，再加入20 μL MTT（5.0 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)約4 h后終止細胞培養(yǎng)。在避光環(huán)境下，將孔內培養(yǎng)液吸凈后加入150 μL的DMSO，低速震蕩10 min。置于酶標儀，檢測570 nm處各孔的吸光度值。按照式（1）計算黃芩苷對HepG2細胞生長的抑制率。

其中，A1為實驗組吸光度均值，A0為對照組吸光度均值。

1.4 細胞凋亡檢測

將經不同濃度黃芩苷（0、50 μmol/L、100 μmol/L）處理24 h的HepG2細胞收集起來后，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入1×結合緩沖液100 μL重懸細胞沉淀，并轉移至流式細胞管中，加Annexin V-FITC 5 μL和 PI 5 μL，避光染色 15 min；加入1×結合緩沖液400 μL，流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC熒光通道為FL1-H，PI熒光通道為FL2-H，獲取細胞數量為15 000個/樣，不足15 000個收取全部細胞；最后于流式細胞儀上機檢測，結果用FlowJo軟件分析，統計細胞凋亡百分率。

1.5 Western Blot實驗

將黃芩苷處理過的HepG2細胞收集起來，經裂解提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取樣20 μL電泳分離、轉膜、5%脫脂奶粉封閉2 h。接對應蛋白一抗孵育過夜（4 ℃、搖床緩慢搖動）。次日，接經辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗孵育2 h（室溫、搖床緩慢搖動）。TBST溶液充分洗凈雜交膜后，在暗室內滴加發(fā)光液，經X-光膠片曝光、顯影、定影處理后，條帶記錄對應蛋白的表達情況。用Image Lab軟件進行定量分析。

1.6 實時熒光定量PCR

收集加黃芩苷后培養(yǎng)24 h的HepG2細胞，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，稀釋。5 ng cDNA、引物各0.4 μmol/L（序列見表 1）和 7.5 μL Mix組成的 15 μL反應體系上機進行實驗。內參基因為GAPDH。ΔΔCt法分析其表達情況。

表1 相關引物序列

2 結果與分析

2.1 黃芩苷抑制HepG2細胞的增殖

通過MTT實驗檢測了黃芩苷對HepG2是否存在增殖抑制效應，如圖1所示，黃芩苷濃度與HepG2細胞增殖抑制率正相關。

圖1 黃芩苷抑制HepG2細胞增殖（劑量依賴）

2.2 黃芩苷誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡

用流式細胞儀檢測經黃芩苷處理后的HepG2細胞凋亡情況，如圖2所示。對照組HepG2細胞的凋亡率為3.71%，早、晚期凋亡率分別為3.08%和0.63%；經50 μmol/L與100 μmol/L黃芩苷處理后，HepG2細胞凋亡率分別為22.20%（19.70%+2.50%）、54.87%（48.80%+6.07%）。結果表明，黃芩苷可有效促進HepG2細胞凋亡，并呈現劑量依賴效應。

圖2 黃芩苷誘導HepG2細胞凋亡

2.3 黃芩苷誘導HepG2細胞內凋亡相關蛋白高表達

經 30 μmol/L、60 μmol/L、90 μmol/L 黃 芩 苷處理24 h后，HepG2細胞內Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達情況如圖3所示，相對表達量如圖4所示。從圖中可以看出，與對照組相比，實驗組HepG2細胞中Caspase-3的表達明顯上調（P＜0.05），Bcl-2相對表達量顯著下調（P＜0.05），Bax的表達明顯上調（P＜0.05)，且呈濃度依賴關系。

圖3 黃芩苷處理后HepG2細胞內凋亡相關蛋白表達Western Blot結果

圖4 黃芩苷處理后HepG2細胞內凋亡相關蛋白相對表達量

2.4 黃芩苷誘導HepG2細胞內凋亡相關分子mRNA高表達

實時定量熒光PCR法檢測不同濃度黃芩苷處理后HepG2細胞中Caspase-3、Bcl-2及Bax的表達量，如圖5所示?？梢钥闯觯珻aspase-3的表達明顯上調（P＜0.05），Bcl-2相對表達量顯著下調（P＜0.05），Bax的表達明顯上調（P＜0.05），且呈濃度依賴關系。

圖5 黃芩苷處理后HepG2細胞內凋亡相關因子的mRNA相對表達量

以上結果表明黃芩苷可誘導HepG2細胞發(fā)生凋亡，且與Bcl-2/Caspase-3信號通路相關。Bcl-2家族和Caspase家族是細胞凋亡的標志性分子，Caspase-3是Caspase家族中多條凋亡通路的共同下游；Bcl-2和Bax可作為上游分子，通過線粒體途徑激活死亡蛋白執(zhí)行酶Caspase-3，參與細胞凋亡的執(zhí)行。其中，Bax基因參與促凋亡，而Bcl-2參與抑制凋亡[7-8]。

近年來，越來越多的報道開始聚焦于黃芩苷抗腫瘤的機制研究，如何更為高效地發(fā)揮中藥小分子類藥物的抗腫瘤效應成為熱點課題。通過本研究前期實驗及相關研究表明，黃芩苷的抗腫瘤機制主要有抑制增殖、調控周期、誘導自噬、促進凋亡等[9-11]。細胞凋亡作為一種細胞起始死亡過程，在腫瘤發(fā)展與治療中具有重要作用[12]。

3 結論

本實驗初步研究了黃芩苷對肝癌腫瘤細胞HepG2的凋亡誘導效應，結果表明其誘導凋亡與Bcl-2/Caspase-3信號通路相關。Caspase家族相關的細胞凋亡的途徑廣泛，其上下游效應分子及相關調控機制也很復雜，本研究僅探討了其中可能的一種通路，還需要進一步探尋黃芩苷發(fā)揮作用的關鍵靶點，為其抗腫瘤機制的研究提供新的參考。