張昕瑋，胡丹丹，李愷，謝有桃，黃利平，鄭學(xué)斌

（中國(guó)科學(xué)院上海硅酸鹽研究所，上海，201899）

0 引言

為賦予金屬骨植入物更良好的生物學(xué)性能，增強(qiáng)其與骨組織間的結(jié)合，需要在其表面制備生物涂層。利用等離子噴涂技術(shù)在鈦合金等表面制備的硅酸鈣(calcium silicate, CS)陶瓷涂層兼具良好生物活性和優(yōu)良力學(xué)性能（特別是結(jié)合強(qiáng)度），有望彌補(bǔ)目前生物醫(yī)用羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)涂層和鈦(Ti)涂層的性能不足[1]。進(jìn)一步的研究表明，在CS 涂層結(jié)構(gòu)中引入一系列生物活性元素（例如鎂、鋅、鍶、硼和鈰等），通過(guò)改變其生物降解行為和生物活性，可以獲得更優(yōu)的成骨性能。鎂黃長(zhǎng)石(Ca2MgSi2O7)陶瓷涂層表面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)黏附和鋪展良好，細(xì)胞增殖和成骨分化速率明顯高于HA 涂層[2]。Zhang 等人[3]提出Sr-CaSiO3涂層的離子產(chǎn)物，尤其是Sr2+，能夠促進(jìn)BMSCs 的堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)并提高體外礦化能力。Yu 等人[4]對(duì)等離子噴涂方法制備鋅黃長(zhǎng)石(Ca2ZnSi2O7)涂層的生物性能研究發(fā)現(xiàn)，與CaSiO3涂層相比，Ca2ZnSi2O7涂層更有利于前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 增殖和ALP 表達(dá)。作者所在課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，相比于Mg2+和Sr2+摻雜，CS 涂層中Zn2+的引入能顯著上調(diào)其表面成骨細(xì)胞內(nèi)I 型膠原(COL-I)和ALP蛋白與基因表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞早期分化[5]。此外，鋅作為重要的無(wú)機(jī)抗菌劑，相比于抗生素，其具有持久抗菌性和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此，CS 涂層中引入Zn2+還能夠賦予涂層抗菌性能，降低骨科植入手術(shù)早期細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)[6]。綜上所述，含鋅的硅酸鈣基涂層具有良好的成骨性能，有望用作骨科植入物用涂層。

除了對(duì)硅酸鈣基涂層的化學(xué)組成進(jìn)行優(yōu)化，涂層表面形貌調(diào)控也是改善骨科植入物生物學(xué)特性的一種有效方法[7]。等離子噴涂技術(shù)是目前制造骨科植入物用HA 和Ti 涂層的常用方法，所制備的涂層表面具有微米級(jí)粗糙結(jié)構(gòu)[8]。對(duì)等離子噴涂涂層進(jìn)行表面納米化改性以形成微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)細(xì)胞快速響應(yīng)，獲得更佳的成骨性能。Wang 等人[9]通過(guò)等離子噴涂和水熱處理制備了具有微/納米形貌的CS 涂層，發(fā)現(xiàn)涂層中納米片結(jié)構(gòu)的引入降低了涂層的降解速率，提高了涂層成骨和成血管化活性。Hu 等人[10]也報(bào)道了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比于等離子噴涂CS 涂層，經(jīng)水熱處理后的CS 涂層表面具有微/納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，而且顯著改善了BMSCs 細(xì)胞的成骨分化能力。由此可見，等離子噴涂和水熱處理的組合使用是在骨科植入物表面構(gòu)建具微/納米形貌涂層的有效策略。等離子噴涂CS 涂層在水熱過(guò)程中引入Zn2+，有望賦予涂層抗菌和促成骨細(xì)胞分化的功能，但是其炎癥反應(yīng)的研究未見報(bào)道。骨免疫學(xué)理論揭示免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)聯(lián)系密切，炎癥細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞等）在骨相關(guān)的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。隨著骨免疫學(xué)研究的深入，骨科植入涂層材料的設(shè)計(jì)思路也由“避免宿主炎癥反應(yīng)”向“主動(dòng)調(diào)控炎癥反應(yīng)”轉(zhuǎn)變。

基于此，本文采用等離子噴涂技術(shù)并結(jié)合水熱處理方法，制備了具有微/納米表面結(jié)構(gòu)的含鋅硅酸鈣基生物涂層，研究涂層材料表面形貌和溶出的生物活性離子對(duì)BMSCs 細(xì)胞成骨能力和RAW264.7 巨噬細(xì)胞極化行為的影響。

1 試驗(yàn)

1.1 涂層樣品制備

采用化學(xué)沉淀法制備CS 粉體，選用燒結(jié)-破碎法對(duì)合成粉體進(jìn)行造粒，以制備成流動(dòng)性好、適合噴涂的顆粒。具體步驟如下：選取Ca(NO3)2·4H2O 和Na2SiO3·9H2O 為 原 材 料，按 照摩爾比為1:1 稱取，用去離子水將兩者分別配置成濃度為0.5 M 溶液。將氨水加入Ca(NO3)2溶液，調(diào)節(jié)pH 值至11，邊攪拌邊滴加Na2SiO3溶液。待沉淀完全后，繼續(xù)攪拌8 小時(shí)。將沉淀物用去離子水、無(wú)水乙醇抽濾洗滌后，80 ℃下烘干8 小時(shí)，在1250 ℃下煅燒并保溫3 小時(shí)，獲得CS 粉體。將粉體壓片，在1250 ℃下煅燒并保溫3 小時(shí)，然后將煅燒后的陶瓷片破碎后過(guò)篩。

使用大氣等離子噴涂設(shè)備，將燒結(jié)-破碎法制得的粉末噴涂于 Ti-6Al-4V 基底上，制備得到CS 涂層，具體參數(shù)見表1。隨后對(duì)CS 涂層進(jìn)行水熱處理。具體步驟如下：稱取Zn(NO3)2，用去離子水配制0.01 M 的溶液。將涂層樣品放置在反應(yīng)釜中，分別取50 mL 去離子水和0.01 M 的Zn(NO3)2溶液作為水熱介質(zhì)加入到反應(yīng)釜中，180℃水熱處理24小時(shí)，制得Zn0-CS、和Zn1-CS涂層。

表1 噴涂工藝參數(shù)Table 1 Plasma spraying parameters

1.2 涂層表面物理化學(xué)性能表征

采用X-射線衍射儀(XRD)測(cè)定粉體和涂層的相結(jié)構(gòu)，連續(xù)掃描范圍為2θ=10～70°，并選用Jade 軟件分峰擬合功能分析涂層物相組成。利用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)觀測(cè)樣品表面形貌和截面組織，樣品化學(xué)元素分布通過(guò)掃描電鏡附帶的元素能譜儀(EDS)進(jìn)行檢測(cè)。采用比表面積測(cè)定儀檢測(cè)涂層的比表面積和總孔體積，使用表面Zeta 電位儀測(cè)量材料的表面電位。采用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-OES)測(cè)量溶液中離子濃度，將涂層材料浸沒于1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2條件下無(wú)菌浸泡1、4 和7 天。收集液體，檢測(cè)其中Ca、Si 和Zn 離子含量，計(jì)算累計(jì)濃度。

1.3 涂層成骨性能表征

將涂層樣品轉(zhuǎn)移到24 孔板內(nèi)，每孔加500μL 細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 小時(shí)。吸走廢液，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)清洗后，將涂層樣品轉(zhuǎn)移至新的24孔板。每孔加入500 μL 1%的十二烷基硫酸鈉，在室溫下?lián)u床1 小時(shí)，使得材料表面蛋白脫落。采用BCA 試劑盒方法檢測(cè)蛋白濃度，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)λ 為562 nm 的吸光度(OD)值。

選取狀態(tài)良好的BMSCs，吸去廢液，PBS 緩沖液輕輕沖洗，用胰酶消化后，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 3×104細(xì)胞/mL。將涂層材料放入48孔板中，加入1 mL 細(xì)胞懸液，在37℃、5% CO2條件下孵育24 小時(shí)，吸去廢液，PBS 緩沖液小心沖洗涂層表面。將材料轉(zhuǎn)移至新的孔板中，用于電鏡觀察。

采用Cell Counting Kit-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。BMSCs 以1×104細(xì)胞/mL 的密度接種在涂層表面，在生長(zhǎng)培養(yǎng)液中培養(yǎng)1、4 和 7 天。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm 的OD 值。采用實(shí)時(shí)-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)涂層表面BMSCs 中基因的表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，BMSCs以5×105細(xì)胞/mL 的密度接種于涂層表面，在細(xì)胞貼壁后，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中繼續(xù)分別培養(yǎng)2和7 天。待到時(shí)間節(jié)點(diǎn)，使用儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程并記錄。第2 天檢測(cè)整聯(lián)蛋白(Integrin)α2、α5、αv、β1、β3 和黏著斑蛋白(vinculin)和黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)相關(guān)基因表達(dá)。待到第7 天，檢測(cè)成骨分化相關(guān)基因，包括核心結(jié)合因子ALP、骨鈣素(OCN)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)和骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá)。

1.4 涂層炎癥反應(yīng)測(cè)試

采用 Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)涂層表面RAW 264.7 巨噬細(xì)胞中基因的表達(dá)。具體來(lái)說(shuō)，RAW 264.7 以5×105細(xì)胞/mL 的密度接種于涂層表面，在37 ℃、5% CO2條件下孵育3 天。待到時(shí)間節(jié)點(diǎn)，利用儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR 反應(yīng)進(jìn)程并記錄。檢測(cè)基因包括趨化因子受體(CCR7)、一氧化氮合成酶(iNOs)、甘露糖受體(CD206)、I 型精氨酸酶(ARG)、大鼠腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6 (IL-6)、白介素-1 受體拮抗劑(IL-1ra)和白介素-10 (IL-10)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都重復(fù)至少三次。用Origin 9.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間數(shù)據(jù)的比較采用方差分析法(ANOVA)，P ＜0.05 即代表組別之間具有顯著性差異，其中*表示P < 0.05, **表示P < 0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 涂層表面的物理化學(xué)性能

圖1(a)～(c)分別是不同放大倍數(shù)下等離子噴涂CS 涂層、純水水熱改性Zn0-CS 涂層和0.01 M的Zn(NO3)2水溶液水熱改性涂層的表面形貌照片。CS 涂層由熔融以及半熔融顆粒堆積而成，表面呈粗糙結(jié)構(gòu)。從圖中可以看出，利用純水和0.01 M Zn(NO3)2溶液為水熱介質(zhì)，經(jīng)過(guò)180 ℃水熱反應(yīng)24 小時(shí)后，CS 涂層表面覆蓋了一層具有納米薄片表面結(jié)構(gòu)（記為Zn0-CS 和Zn1-CS）。有研究表明[11]，溶液中鈣硅比能夠調(diào)控形成的水合硅酸鈣形貌，較低鈣硅比的水化硅酸鈣微觀結(jié)構(gòu)主要呈片狀，隨著鈣硅比提高出現(xiàn)短粗的針棒狀，當(dāng)鈣硅比繼續(xù)提高則以細(xì)長(zhǎng)的針棒狀為主。

圖1 涂層的表面形貌：(a1), (a2) CS; (b1), (b2) Zn0-CS; (c1), (c2) Zn1-CSFig. 1 SEM images of the coatings: (a1), (a2) CS; (b1), (b2) Zn0-CS; (c1), (c2) Zn1-CS

圖2 是CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層的截面背散射形貌。Zn1-CS 涂層截面厚度明顯增加。為了進(jìn)一步觀察CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層中各元素分布變化情況，對(duì)涂層截面進(jìn)行了面掃描分析。從圖中可以看出CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層中Ca、Si 和O 元素分布均勻，Zn1-CS 涂層中Zn 元素主要集中在涂層表面。

圖2 涂層截面SEM 形貌和元素面掃描：(a) CS; (b) Zn0-CS; (c) Zn1-CSFig. 2 SEM images of the coatings and elements mappings: (a) CS; (b) Zn0-CS; (c) Zn1-CS

圖3 是CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂 層 表 面的XRD 圖譜。由圖中可以看出，CS 涂層表面主要由α-CaSiO3相組成，同時(shí)存在大量非晶相。Zn0-CS 涂層表面α-CaSiO3主相的特征峰強(qiáng)度略降低，同時(shí)出現(xiàn)托貝莫來(lái)石相。Zn1-CS 涂層中α-CaSiO3相基本消失，表面出現(xiàn)新的物相Zn4Si2O7(OH)2(H2O)，與截面元素分布結(jié)果相符合。

圖3 CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層的XRD 圖譜Fig. 3 XRD patterns of the CS, Zn0-CS and Zn1-CS coatings

表2 是CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層部分表面性質(zhì)，包括比表面積、總孔體積（孔容）以及表面Zeta 電位。Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層比表面積和孔容均有提高，比表面積分別是CS 涂層的1.3 和1.6 倍，而孔容分別達(dá)到CS 涂層的12.2 和36.0 倍。Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面納米片狀結(jié)構(gòu)相互堆積而形成的狹縫孔，有助于提高涂層總孔體積（孔容）。有學(xué)者[12]研究發(fā)現(xiàn)具有納米結(jié)構(gòu)的材料擁有高的比表面積，能夠富集蛋白質(zhì)，激活整聯(lián)蛋白相關(guān)信號(hào)通路，繼而調(diào)控細(xì)胞粘附、增殖與分化行為，改善植入物的表面生物學(xué)性能。另外，Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面Zeta 電位有所降低。表面電勢(shì)降低可能是由于硅酸鈣涂層水熱處理后表面形成電負(fù)性的Si-OH[13]。

表2 涂層的表面性質(zhì)Table2 The surface properties of the coatings

圖4 是CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層浸泡于細(xì)胞培養(yǎng)液中1 天后的Ca、Si 和Zn 離子濃度。從圖中可以看出，Zn1-CS 涂層中Ca 和Si 離子釋放量顯著低于CS 和Zn0-CS 涂層。這與Zn1-CS 涂層表面形成穩(wěn)定新物相Zn4Si2O7(OH)2(H2O)有關(guān)。有研究[14]報(bào)道，一定含量的Zn2+釋放，能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等行為。

圖4 CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層浸泡于細(xì)胞培養(yǎng)液中1 天的離子溶出量Fig. 4 Ca, Si and Zn ion concentration from the coatings in the cell culture medium for 1 day

2.2 具微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的含鋅硅酸鈣涂層的成骨性能

為了研究納米片表面結(jié)構(gòu)與Zn 離子對(duì)生物學(xué)性能的影響，將Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層作為研究對(duì)象，CS 涂層作為對(duì)照。圖5 (a)和(b)分別是CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層浸泡于細(xì)胞培養(yǎng)液中2 小時(shí)后的總蛋白和纖連蛋白FN 吸附量的結(jié)果。相較于CS 涂層，Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面總蛋白吸附量略有增加，且Zn0-CS 涂層表面總蛋白吸附量最高。這可能是因?yàn)閆n0-CS 涂層表面Zeta 電位高于Zn1-CS，有利于帶負(fù)電的蛋白質(zhì)的靜電吸附。另外，Zn1-CS 涂層表面FN 吸附量顯著高于Zn0-CS 涂層。以上結(jié)果表明，納米表面結(jié)構(gòu)整體對(duì)總蛋白吸附影響有限，Zn 的引入能夠顯著促進(jìn)FN 吸附。特異性蛋白FN，廣泛參與細(xì)胞遷移、粘附、增殖及組織修復(fù)等過(guò)程，調(diào)動(dòng)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除損傷組織處有害物質(zhì)，具有趨化因子作用。

圖5 CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面浸泡于細(xì)胞培養(yǎng)液中2 小時(shí)后：(a) 總蛋白吸附量；(b) 纖連蛋白吸附量Fig.5 CS, Zn0-CS and ZN1-CS coating surfaces were immersed in cell culture medium after 2 hours:(a) serum protein adsorption; (b) fibronectin adsorption

圖6 是CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂 層 表 面BMSCs 粘附24 小時(shí)后的SEM 形貌。從圖中可以看出，CS 涂層表面細(xì)胞只有輕微鋪展，呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)形態(tài)，與涂層表面復(fù)雜形貌相適應(yīng)。Zn0-CS 涂層表面細(xì)胞鋪展良好，具有典型的多邊形的成骨細(xì)胞的形態(tài)，但只有少量偽足形成。Zn1-CS 涂層表面細(xì)胞鋪展程度更高，且質(zhì)膜外突起伸展形成較多絲狀偽足牢固地粘附于材料表面。結(jié)果表明，納米表面結(jié)構(gòu)具有較好的細(xì)胞相容性，能支持細(xì)胞的粘附與鋪展。

圖6 涂層表面培養(yǎng)24 小時(shí)后的BMSCs 的SEM 形貌：(a) CS; (b) Zn0-CS; (c),(d) Zn1-CSFig.6 SEM morphologies of BMSCs cultured on the coating surfaces for 1 day: (a) CS; (b) Zn0-CS; (c), (d) Zn1-CS

利用Real-time PCR 技術(shù)檢測(cè)BMSCs 在涂層表面培養(yǎng)2 天后的粘附相關(guān)基因表達(dá)。從圖7 中結(jié)果可以看出，相較于CS 涂層，Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面細(xì)胞Integrin 以及下游vinculin 和FAK 均有顯著提高，結(jié)果表明納米表面結(jié)構(gòu)顯著促進(jìn)Integrin 相關(guān)基因表達(dá)。

圖7 BMSCs 在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面培養(yǎng)2 天后：(a) Integrin α2、α5、αv、β1、β3 表達(dá)結(jié)果；(b) vinculin 和FAK 因子表達(dá)結(jié)果Fig.7 BMSCs were cultured on CS, Zn0-CS and ZN1-CS coatings for 2 days:(a) gene expression of integrin α2, α5, α V, β1, β3; (b) gene expression of Vinculin and FAK factors

圖8 是BMSCs 在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面培養(yǎng)1、4 和7 天的CCK-8 分析結(jié)果。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，三種涂層表面細(xì)胞數(shù)量均增加，均能支持BMSCs 的增殖行為。在同一時(shí)間內(nèi)，BMSCs 在Zn1-CS 涂層表面細(xì)胞數(shù)量最多，而在Zn0-CS 涂層表面細(xì)胞數(shù)量最少。Zn0-CS 涂層表面細(xì)胞增殖速率降低的原因，可能是由于細(xì)胞與涂層表面納米結(jié)構(gòu)緊密地結(jié)合從而阻礙了細(xì)胞遷徙與分裂。Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面形貌接近，但Zn1-CS 涂層在細(xì)胞培養(yǎng)液中釋放少量的Zn2+，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。

圖8 BMSCs 在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層的表面培養(yǎng)1、4 和7 天的CCK-8 分析結(jié)果Fig.8 The BMSCs proliferation of cultured on the coatings for 1, 4 and 7 days

圖9 是BMSCs 在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面培養(yǎng)7 天后的成骨分化和成血管化相關(guān)基因表達(dá)。從圖中可以看出，相較于CS 和Zn0-CS 涂層，Zn1-CS 涂層表面BMSCs 成骨分化基因ALP、OCN 表達(dá)顯著增加。結(jié)果表明，納米表面結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)成骨分化基因ALP 和OCN 的表達(dá)，Zn 的引入能夠進(jìn)一步增強(qiáng)成骨分化作用。雖然Zn1-CS 涂層表面BMSCs 成血管分化基因HIF-1α 表達(dá)有所增加，但VEGF 表達(dá)無(wú)顯著變化。另外，BMSCs 在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面培養(yǎng)7 天后的破骨分化相關(guān)基因OPG、RANKL表達(dá)以及OPG/RANKL 比值無(wú)顯著性差異。OPG/RANKL 比值是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生物學(xué)性能和骨吸收最終效應(yīng)的決定性因素，比值越高表明抑制破骨分化能力越強(qiáng)。結(jié)果表明Zn1-CS 涂層顯著促進(jìn)BMSCs 成骨分化，但對(duì)成血管化和抑制破骨分化作用甚微。

圖9 BMSCs 在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面培養(yǎng)7 天后的骨相關(guān)基因表達(dá)情況：(a) ALP、OCN、HIF-1a、VEGF; (b) OPG、RANKL、OPG/RANKLFig. 9 Bone-related gene expression of BMSCs cultured on the CS, Zn0-CS and Zn1-CS coating surfaces for 7 days:(a) ALP、OCN、HIF-1a、VEGF; (b) OPG、RANKL、OPG/RANKL

2.3 具微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的含鋅硅酸鈣涂層的炎癥反應(yīng)

巨噬細(xì)胞作為固有免疫的重要組成部分，其效應(yīng)功能對(duì)于骨科植入物愈合過(guò)程中炎癥的發(fā)展和纖維化的發(fā)生發(fā)揮重要作用[15]。人們通常用經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞（M1 型）和替代活化巨噬細(xì)胞（M2 型）來(lái)區(qū)分其效應(yīng)功能，其中M1 型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)炎癥的功能，傾向于引起慢性炎癥反應(yīng)和纖維化，相比之下，M2 型巨噬細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建，傾向于終結(jié)炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織愈合。圖10 是RAW 264.7 細(xì)胞在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層培養(yǎng)3 天后的M1 和M2 表型相關(guān)基因表達(dá)，檢測(cè)基因包括CCR7、iNOs、CD206 和ARG。從圖中可以看出，相較于CS 涂層，Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面細(xì)胞M1 表型因子（CCR7和iNOs）略有降低，而M2 表型因子（CD206 和ARG）表達(dá)顯著增加，其中Zn1-CS 涂層細(xì)胞M2表型因子表達(dá)顯著高于Zn0-CS 涂層。

圖10 RAW 264.7 細(xì)胞在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面培養(yǎng)3 天后的M1 和M2 表型標(biāo)記：(a) CCR7; (b) iNOs; (c) CD206; (d) ARGFig.10 Relative mRNA expressions of the M1 marker (CCR7 and iNOs) and M2 marker (CD206 and ARG)by RAW 264.7 cells cultured on the CS, Zn0-CS and Zn1-CS coatings: (a) CCR7; (b) iNOs; (c) CD206; (d) ARG

圖11 是RAW 264.7 細(xì) 胞 在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層培養(yǎng)3 天后的炎癥相關(guān)因子表達(dá)，檢測(cè)的基因包括TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-1ra 和IL-10。從圖中可以看出，相較于CS 涂層，Zn0-CS和Zn1-CS 涂層表面細(xì)胞促炎癥因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）表達(dá)略有降低，而抑炎癥因子（IL-1ra和IL-10）表達(dá)顯著增加，其中Zn1-CS 涂層表面細(xì)胞抑炎癥因子表達(dá)顯著高于Zn0-CS 涂層。Varmette 等人[16]研究結(jié)果也證實(shí)，摻Zn 的58S生物活性玻璃(Zn-58S)能夠顯著降低由內(nèi)毒素脂多糖刺激產(chǎn)生的TNF-α 和IL-6，具有抗炎癥的效應(yīng)。結(jié)果表明，納米表面結(jié)構(gòu)能顯著促進(jìn)抑炎癥因子表達(dá)，有利于創(chuàng)建良好的骨免疫微環(huán)境，Zn的引入進(jìn)一步促進(jìn)了這一過(guò)程。

圖11 RAW 264.7 細(xì)胞在CS、Zn0-CS 和Zn1-CS 涂層表面培養(yǎng)3 天后的炎癥相關(guān)基因表達(dá)情況：(a) TNF-a; (b) IL-1b; (c) IL- 6; (d) IL-1ra; (e) IL-10Fig.11 Relative mRNA expressions of inflammation related genes by RAW 264.7 cells cultured on the CS,Zn0-CS and Zn1-CS coatings: (a) TNF-a; (b) IL-1b; (c) IL- 6; (d) IL-1ra; (e) IL-10

3 結(jié)論

(1) 等離子噴涂CS 涂層表面引入納米片結(jié)構(gòu)可提高其比表面積和孔容，能夠吸附更多血清蛋白和特異性蛋白FN，通過(guò)刺激整聯(lián)蛋白以及下游vinculin 和FAK 基因表達(dá)，提高了BMSCs 鋪展能力。涂層中Zn2+的引入進(jìn)一步提高了其表面BMSCs 的增殖能力和與成骨相關(guān)的ALP 和OCN基因表達(dá)，可誘導(dǎo)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化。

(2) 等離子噴涂CS 涂層中引入納米片結(jié)構(gòu)能夠上調(diào)RAW264.7 巨噬細(xì)胞中M2 表型因子（CD206 和ARG）表達(dá)，Zn2+的引入進(jìn)一步促進(jìn)了抑炎癥因子IL-1ra 和IL-10 表達(dá)，促使RAW 264.7 細(xì)胞向抑炎癥M2 型轉(zhuǎn)化，這有利于創(chuàng)建良好的骨免疫微環(huán)境，促進(jìn)骨形成的發(fā)生。