董琪，鮑偉，劉露,2，李娜,3，吳兵,吳文睿,2*

(1.亳州學院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800)；2.養(yǎng)生型配制酒亳州市重點實驗室，安徽 亳州 236800；3.藥食同源功能食品亳州市重點實驗室，安徽 亳州 236800)

我國桑樹資源豐富，包括桑葉、枝、根皮和果，中醫(yī)藥典籍、驗方中多有桑樹資源用于治療疾病的記載[1]。桑白皮為?？浦参锷?Morus alba L.)的干燥根皮，有瀉肺平喘、利水消腫之功效[2]。桑白皮以產(chǎn)區(qū)分為亳桑皮(安徽亳州)，嚴桑皮(浙江淳安)、蘇北桑皮(江蘇泰興、南通)三大產(chǎn)區(qū)，其中安徽亳州產(chǎn)桑白皮因產(chǎn)量大、色白、皮厚、柔韌者、質(zhì)量好而優(yōu)于江浙兩處，故亳州桑白皮稱為“亳桑皮”[3]，享譽全國。亳桑皮降血糖、降血壓、抗病毒、利尿等藥用價值也被充分挖掘，受到了醫(yī)學界的認可[4]。目前，對桑白皮的研究多集中在不同產(chǎn)地[5]、疾病治療[6]、藥理藥效[7-8]化學成分分析[9]、炮制[10-11]等方面。

亳白皮所含的化學成分主要為黃酮類物質(zhì)，如桑素、桑黃酮、桑白皮素、桑根酮等，具有降血糖和血脂，鎮(zhèn)咳平喘、消炎抗氧化等藥理作用[12]。本研究結(jié)合超聲波輔助法，采用單因素實驗和正交實驗設計，對亳桑皮總黃酮提取工藝進行了優(yōu)化;以維生素 C 作為陽性對照，對亳桑皮黃酮的抗氧化活性進行研究，為亳桑皮的進一步開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亳桑皮：購買于亳州康美大市場；蘆丁標準品(含量≥99%)：江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司；三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、過硫酸鉀、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、無水乙醇、均為分析純，天津致遠化學試劑有限公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：Ruibio公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(PH=8.2)：廈門海標科技有限公司。

UV-752 型紫外分光光度計，上海光譜儀器廠；WB400US超聲波清洗器，上海望標儀器有限公司；DE-200g高速萬能粉碎機，浙江紅景天工貿(mào)有限公司；JA2003電子分析天平，上海衡平儀器儀表廠；BGZ-140電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；L600高速臺式離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-3A單列單控三孔水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 亳桑皮處理：亳桑皮→篩選→清洗→低溫干燥→粉碎→過篩(40目)→保存?zhèn)溆谩?/p>

亳桑皮黃酮提取液制備：精密稱取5 g亳桑皮粉，按照單因素和正交試驗料液比要求，超聲提取，過濾，去殘渣，將濾液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，用一定濃度的乙醇稀釋至刻度，得樣品液，備用。

1.2.2 總黃酮含量的測定 蘆丁標準曲線制備：以蘆丁為標樣，采用分光光度法制作蘆丁標準曲線，參考相關文獻略有修改[13]。準確稱量50 mg蘆丁標準品置于50 mL容量瓶中定容，得1 mg/mL的蘆丁標準品溶液。分別取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的1 mg/mL蘆丁標準品溶液分別置于10 mL容量瓶中定容，每個容量瓶的濃度即為0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。分別取1 mL不同濃度標準液于7支試管中，滴加5% NaNO2溶液0.3 mL，震蕩混勻，靜置6 min，再滴加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，震蕩混勻，靜置6 min；加入 4% NaOH溶液4.0 mL、4.4 mL60%乙醇，震蕩混勻，靜置15 min，在510 nm波長處測量吸光度，每樣需平行3次。以吸光度值為縱坐標(Y)，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，得到標準曲線得回歸方程為 y = 0.1043x—0.0887，R2=0.9826，線性關系良好，可用于亳桑皮總黃酮的測定。檢測樣品中提取總黃酮與亳桑皮樣品的質(zhì)量百分比即為總黃酮的提取率。

1.2.3 亳桑皮提取工藝優(yōu)化設計 乙醇體積分數(shù)對亳桑皮總黃酮提取率的影響：稱取亳桑皮粉末5 g，料液比為1:30(g/mL)，超聲波時間45 min，溫度為60 ℃，乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、80%，在此條件下測量亳桑皮總黃酮的提取率。

提取溫度對亳桑皮總黃酮提取率的影響：稱取亳桑皮粉末5 g，在最佳乙醇體積分數(shù)條件下，料液比為1∶30(g/mL)，超聲波時間45 min，溫度分別為30、45、60、75 ℃，在此條件下測定亳桑皮總黃酮的提取率。

提取料液比對亳桑皮總黃酮提取率的影響：稱取亳桑皮粉末5 g，在最佳乙醇體積分數(shù)和溫度條件下，超聲波時間45 min，料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在此條件下測定亳桑皮總黃酮的提取率。

超聲時間對亳桑皮總黃酮提取率的影響：稱取亳桑皮粉末5 g，在最佳乙醇體積分數(shù)、溫度和料液比條件下，超聲波分別處理30、45、60、75 min，在此條件下測量亳桑皮總黃酮的提取率。

在單因素試驗的基礎上，選取乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比和超聲波處理時間4個因素，每個因素取3個水平，以亳桑皮總黃酮提取率作為考察指標，進行L9(34)正交試驗設計(見表1)，得到最佳提取條件。

表1 正交試驗因素水平表L9(34)

1.2.4 亳桑皮黃酮的抗氧化活性測定 亳桑皮黃酮提取物對DPPH·清除能力的測定：參照文獻[14-15]中DPPH·法測定抗氧化能力，略有修改。將亳桑皮黃酮提取液配置成不同的質(zhì)量濃度，分別取2 mL樣品，然后加入2 mL的0.1 mmol/L DPPH(以無水乙醇作為溶劑)，混勻，于黑暗條件下反應30 min，于517 nm處測定吸光度。以 VC為陽性對照。亳桑皮黃酮對DPPH·的清除率依據(jù)下列公式計算：

清除率(%)=[1-(A-A0)/A1]×100

(1)

其中，A為樣品組與自由基溶液混合后的吸光度值；A0為樣品本身的吸光度，未加自由基溶液；A1為未加樣，只加自由基溶液的吸光度值。

亳桑皮黃酮提取物對ABTS·清除能力的測定：參照文獻[16]中ABTS·法測定抗氧化能力，略有修改。將7 mmol/L ABTS溶液10 mL與140 mmol/L的過硫酸鉀溶液0.2 mL在黑暗中混勻靜止15 h，得ABTS自由基溶液。將該溶液配制成不同質(zhì)量濃度，備用。將1 mL亳桑皮總黃酮提取液、2 mL ABTS自由基溶液及1 mL蒸餾水依次加入試管中，于黑暗條件下反應30 min，后于734 nm 下測定吸光度。通過公式(1)計算清除率并以VC為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

單因素實驗結(jié)果如圖1—4所示。由圖1可知，亳桑皮黃酮提取率隨乙醇體積分數(shù)的増大而逐漸提高，但當乙醇體積分數(shù)大于70 %后，提取率略有下降，增加乙醇濃度，總黃酮的提取率反而降低，可能是因為高濃度乙醇對樣品中脂類物質(zhì)產(chǎn)生一定的溶解性所致。而乙醇體積分數(shù)60 %時亳桑皮總黃酮提取率與70 %接近。因總黃酮為極性化合物，結(jié)合相似相溶原理，調(diào)節(jié)不同體積分數(shù)的乙醇溶液，改變其極性，達到總黃酮的提取效果最佳。綜合考慮選取乙醇體積分數(shù)為60 %，作為后面的試驗繼續(xù)考察。

圖1 不同乙醇體積分數(shù)對亳桑皮總黃酮提取率的影響 圖2 提取溫度對對亳桑皮總黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著提取溫度不斷升高，亳桑皮總黃酮提取率逐漸增高；提取溫度在60 ℃時提取率達到最大值，溫度過高可能會導致總黃酮分解或揮發(fā)。由此選取提取溫度為60 ℃，作為后面的試驗繼續(xù)考察。

由圖3可知，提取劑的增加更有利于總黃酮的溶出，亳桑皮總黃酮提取率隨物料與溶劑的比例的増大而呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當料液比大于1:30時，總黃酮的提取率有下降趨勢，可能因為當溶劑過大時，熱效應、空化效應和機械效應等效應的強度減弱，影響提取的效果，也一定程度上造成浪費。由此選取料液比為1:30 g/mL，作為后面的試驗繼續(xù)考察。

圖3 料液比對亳桑皮總黃酮提取率的影響 圖4 超聲時間對亳桑皮總黃酮提取率的影響

由圖4可知，超聲30 min，亳桑皮總黃酮不能充分轉(zhuǎn)移到溶劑中，隨著超聲時間的延長，總黃酮的提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，超聲時間在45 min時，提取率達到最大值，因此選取提取時間為45 min，作為后面的試驗繼續(xù)考察。

2.2 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果如表2所示。根據(jù)極差分析，各因素對亳桑皮總黃酮提取率的影響由大到小分別是料液比>超聲時間>提取溫度>乙醇體積分數(shù)，最佳組合為A2B3C3D3，即亳桑皮總黃酮最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)為60 %、提取溫度為65 ℃、料液比(g/mL)為1:35、超聲時間為50 min。通過驗證性試驗可知，按照最佳的提取工藝，亳桑皮總黃酮的提取率為3.52 %。

表2 正交試驗結(jié)果L9(34)

2.3 亳桑皮黃酮的抗氧化活性測定結(jié)果

亳桑皮對DPPH·清除率測定結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，較維生素C相比，亳桑皮黃酮對DPPH·有較強的清除率，隨著亳桑皮黃酮溶液濃度的增大，其對DPPH·的清除率越來越高，清除效果與濃度之間都存在明顯的量效關系。在黃酮濃度20～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，其對 DPPH·的清除能力為25.6～73.4 %。亳桑皮黃酮清除DPPH·的IC50值為32.05 μg/mL。

圖5 亳桑皮黃酮清除DPPH·的能力 圖6 亳桑皮黃酮清除ABTS·的能力

亳桑皮對ABTS·清除率測定結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，較維生素C相比，亳桑皮黃酮對ABTS·的清除率略低于維生素C，但仍有較強的清除率，隨著亳桑皮黃酮溶液濃度的增大，其對ABTS·的清除率越來越高，清除效果與濃度之間都存在明顯的量效關系。在黃酮濃度20～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，其對 ABTS·的清除能力為34.2～79.4 %。亳桑皮黃酮清除ABTS·的IC50值為26.48 μg/mL。

圖7 亳桑皮黃酮清除的能力

3 結(jié)論

本文通過單因素實驗和正交試驗設計，借助超聲波輔助提取亳桑皮總黃酮，得到最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)為60 %、提取溫度為65 ℃、料液比(g/mL)為1:35、超聲時間為50 min，亳桑皮黃酮的提取率為3.52 %。