智亞楠，趙筱岑，常衛(wèi)格，王霄陽(yáng)，李甜甜，陳利軍

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，河南 信陽(yáng)464000)

使用化學(xué)農(nóng)藥防治植物病害是目前植物生產(chǎn)中的常用手段，然而化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人類的生活造成了一定的困擾，最突出的問(wèn)題就是農(nóng)藥殘留和植物病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，尋找安全、綠色的新型殺菌劑顯得尤為重要。植物揮發(fā)油是植物的重要次生代謝產(chǎn)物，具有分子量較小、易揮發(fā)的特點(diǎn)，因其獨(dú)特的生物活性，在植物保護(hù)、食品保鮮、飼料添加、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[1]。

近年來(lái)，不斷有人研究發(fā)現(xiàn)各種植物揮發(fā)油的抑菌作用，植物揮發(fā)油作為一類新型的殺菌劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。例如山蒼子油對(duì)油茶炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和水稻稻瘟病菌的生長(zhǎng)均有抑制作用[2]。肉桂揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗菌活性，不但可以有效抑制沙門氏菌、黃色葡萄球菌等多種病原性微生物，而且對(duì)食品儲(chǔ)藏過(guò)程中霉腐微生物的生長(zhǎng)起到抑制作用，從而達(dá)到防腐保鮮的目的[3]。

羅勒(Ocimumbasilicum)和紫蘇(Perillafrutescens)是唇形科中常見(jiàn)的芳香植物材料，含有豐富的揮發(fā)油。在活性方面，有研究者發(fā)現(xiàn)羅勒揮發(fā)油對(duì)茶樹(shù)的小貫小綠葉蟬有抑制趨避效果；對(duì)繡線菊蚜、甜菜蚜、谷斑皮蠹、赤擬谷盜和無(wú)花果粉蚧也有殺蟲活性[4-5]。另外，羅勒揮發(fā)油對(duì)小茴香根腐病菌具有良好的抑制作用[6]，對(duì)櫻桃番茄的貯藏保鮮也有一定的作用[7]。紫蘇葉揮發(fā)油具有良好的藥用價(jià)值，有抗氧化、抗炎、抗菌和增強(qiáng)免疫力的作用，可作為保健品調(diào)理人體機(jī)能，作為抗衰老成分用于護(hù)膚品中[8]。另外紫蘇揮發(fā)油能明顯地抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌三類細(xì)菌的活性，在食品保鮮上也有良好的應(yīng)用價(jià)值[9]。但這2種揮發(fā)油在植物病原菌控制上研究較少。

本試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法分別提取羅勒和紫蘇植株的揮發(fā)油，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)分析揮發(fā)油的化學(xué)組分，并以番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌和半夏白絹病菌4種植物病原真菌為供試菌，測(cè)定2種揮發(fā)油的熏蒸抑菌活性。從而為羅勒和紫蘇揮發(fā)油在植物殺菌劑發(fā)面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羅勒和紫蘇：羅勒于超市采購(gòu)；紫蘇采集于信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院周圍田地，選取健康植株，剪成3 cm左右的小段。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、水。

植物病原真菌：番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和花生白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)，由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離保存。

主要儀器與設(shè)備：Agilent 6850/5975氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)、NIST14譜庫(kù)、HP-250S生化培養(yǎng)箱、KDM-2000電熱套(金壇市恒豐儀器制造有限公司)、立式高壓蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)等。

1.2 揮發(fā)油的提取

羅勒和紫蘇揮發(fā)油的提取采用水蒸氣蒸餾法[10]。在5000 mL的圓底燒瓶中加入一定量的蒸餾水，稱取植株小段500 g，裝入圓底燒瓶中，浸泡3 h，連續(xù)蒸餾提取4 h至油量不再增加。靜置分層后讀取揮發(fā)油體積，并分離油水混合物，收集揮發(fā)油，得到具有特殊濃郁氣味的油狀液體，保存于4℃冰箱備用。

1.3 揮發(fā)油GC-MS分析條件

分析條件參考陳利軍[11]等測(cè)定揮發(fā)油的條件。色譜條件：色譜柱為HP-5ms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫，初始柱溫為60℃，保持2 min，以10℃/min升溫速率升至230℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣前揮發(fā)油用乙醚稀釋，進(jìn)樣量為1.0 μL，不分流。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍33～350 amu。

1.4 揮發(fā)油熏蒸抑制作用測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法，在培養(yǎng)皿內(nèi)熏蒸處理測(cè)定揮發(fā)油對(duì)植物病原菌的抑制作用[11]。將直徑為7 mm的圓形濾紙片，干熱滅菌后備用。在直徑90 mm的培養(yǎng)皿中制成厚薄均勻的PDA平板。取培養(yǎng)3 d的植物病原菌平板，在菌落邊緣打取直徑為5 mm菌餅，接種在平板中央。然后在皿蓋上對(duì)應(yīng)放置已滅菌的圓形濾紙片，在濾紙片上分別滴加羅勒和紫蘇揮發(fā)油。皿底皿蓋對(duì)扣后，用封口膜密封，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。以濾紙片上不滴加揮發(fā)油為對(duì)照，重復(fù)3次。72 h后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌的抑菌率。

菌落生長(zhǎng)抑制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑]×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS22.0計(jì)算有效中濃度(EC50)及其置信區(qū)間，并根據(jù)EC50值比較揮發(fā)性油對(duì)不同植物病原真菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅勒和紫蘇揮發(fā)油組分GC-MS分析

利用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)羅勒和紫蘇揮發(fā)油組分進(jìn)行分析，總離子流量圖分別如圖1和圖2所示。利用色譜峰面積歸一法測(cè)得各組分的相對(duì)含量，所得質(zhì)譜圖經(jīng)NIST05質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索；與標(biāo)準(zhǔn)圖譜核對(duì)，并結(jié)合化學(xué)物質(zhì)登錄號(hào)(CAS號(hào))分析，羅勒和紫蘇揮發(fā)油組分如表1和表2所示。

圖1 羅勒揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖 圖2 紫蘇揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

從表1可看出，從羅勒揮發(fā)油中分離到19種組分，鑒定了17個(gè)，占總組分的94.723%。羅勒揮發(fā)油中相對(duì)含量較高的組分分別為芳樟醇(33.749%)，其次為乙基異丙醚(22.033%)和桉樹(shù)腦(6.893%)等。從表2可看出，從紫蘇揮發(fā)油中共分離到8個(gè)組分，鑒定出了其中的6個(gè)組分，占揮發(fā)油總量的97.7%。其中相對(duì)含量最高的組分分別為2-丁酰呋喃(79.093%)和2-呋喃甲酰乙腈(12.398%)。

表1 羅勒揮發(fā)油化學(xué)組分分析結(jié)果

表2 紫蘇揮發(fā)油化學(xué)組分分析結(jié)果

2.2 羅勒和紫蘇揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌的熏蒸抑制作用

羅勒揮發(fā)油對(duì)4種供試的植物病原真菌均具有良好帶的熏蒸抑制作用，隨著揮發(fā)性油劑量的增加而抑制作用增強(qiáng)。在4.0 μL/皿時(shí)，羅勒揮發(fā)油對(duì)供試病原菌的抑菌率均達(dá)到50%以上，在6.0 μL/皿時(shí)對(duì)花生白絹病菌的抑制率達(dá)到85.57%(圖3，表3)。

注：第一排左起濃度依次為0、0.5、1.0 μL/皿；第二排左起依次為2.0、4.0、6.0 μL/皿

表3 羅勒揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的熏蒸抑制作用

紫蘇揮發(fā)油同樣對(duì)4種供試的植物病原真菌具有良好帶的熏蒸抑制作用。當(dāng)劑量為1.0 μL/皿時(shí)，紫蘇揮發(fā)油對(duì)花生白絹病菌和番茄灰霉病菌的抑制率均達(dá)到50%及以上，2.0 μL/皿時(shí)，對(duì)萵苣菌核病菌的抑菌率達(dá)到51.30%，當(dāng)劑量為6.0 μL/皿時(shí)對(duì)4種供試病原菌的抑制率在67.96%～97.81%(圖4、表4)。

注：第一排左起濃度依次為0、0.5、1.0 μL/皿；第二排左起依次為2.0、4.0、6.0 μL/皿

表4 紫蘇揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的熏蒸抑制作用

表5為羅勒揮發(fā)油對(duì)4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定結(jié)果?？梢钥闯?，羅勒揮發(fā)油對(duì)花生白絹病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50僅為1.50 μL/皿，對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用相對(duì)較弱，EC50為3.40 μL/皿。

表5 羅勒揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定結(jié)果

紫蘇揮發(fā)油對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.64 μL/皿，對(duì)花生白絹病菌的作用次之，EC50為0.99 μL/皿。對(duì)油菜菌核病菌和小麥赤霉病菌的EC50分別為為1.44 μL/皿和2.48 μL/皿(表6)。除小麥赤霉病菌外，紫蘇揮發(fā)油對(duì)另外3種病原菌的毒力均比羅勒揮發(fā)油強(qiáng)。

表6 紫蘇揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的毒力測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法分別提取了唇形科植物羅勒和紫蘇的揮發(fā)油，利用GC-MS分析鑒定發(fā)現(xiàn)，羅勒揮發(fā)油主要組分為芳樟醇(33.749%)、乙基異丙醚(22.033%)和桉樹(shù)腦(6.893%)等，這與Kostic等[12]人研究結(jié)果相似。而黃麗沄等[13]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)羅勒揮發(fā)油中丁香酚、酞酸二乙酯、草蒿腦和石竹烯含量相對(duì)較高。本試驗(yàn)中紫蘇揮發(fā)油主要組分分別為2-丁酰呋喃(79.093%)和2-呋喃甲酰乙腈(12.398%)。姚正穎等[14]從江蘇產(chǎn)紫蘇干品中提取揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)2-丁酰呋喃含量高達(dá)72.32%，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。而孟青等[15]采用GC-MS法對(duì)水蒸氣蒸餾提取湖北產(chǎn)紫蘇葉莖揮發(fā)油分析，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油的主要成分是紫蘇醛、檸檬烯、反式-石竹烯等；鄭梅琴等[16]發(fā)現(xiàn)江西產(chǎn)紫蘇揮發(fā)油主要成分為洋芹醚；與本試驗(yàn)差異較大。這些差異可能是由于植物的產(chǎn)地、品種不同所造成的。

在本試驗(yàn)中通過(guò)熏蒸抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅勒和紫蘇揮發(fā)油對(duì)番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌、小麥赤霉病菌和花生白絹病菌均具有良好的熏蒸抑制作用。羅勒揮發(fā)油對(duì)4種供試菌的EC50為1.50～3.40 μL/皿，這種結(jié)果可能與羅勒揮發(fā)油中含有較多的芳樟醇有關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，天然芳樟醇對(duì)于柑橘炭疽病菌、辣椒疫病菌、胡蘿卜菌核病菌和柑橘褐色蒂腐病菌4種果蔬致病菌均有較強(qiáng)的抑菌效果[17]。而紫蘇揮發(fā)油對(duì)4種供試菌的EC50為0.64～2.48 μL/皿。由于植物揮發(fā)油環(huán)境相容性好，具有潛力作為熏蒸型殺菌劑用于病害防控。但植物揮發(fā)油組分復(fù)雜，且組分受環(huán)境、品種等的影響，如何在生產(chǎn)上應(yīng)用還需進(jìn)一步探討。