程磊,董卓倬,杜用璽，陳夕軍,姚 潔,王鐵霖, 賀 振*

(1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 亳州 236800；2.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 236800；3.揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心 道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700)

地黃為玄參科植物地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)的新鮮或干燥塊根，具有清熱生津、涼血、止血、養(yǎng)陰生津功效[1]，有重要的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是我國(guó)大宗藥材之一[2]。地黃主要分布于河南、山西、山東、陜西、河北等省份。地黃病害有多種，主要包括斑枯病、根腐病、輪紋病和病毒病等，這些病害導(dǎo)致地黃減產(chǎn)，嚴(yán)重危害生產(chǎn)[3-5]。河南溫縣是重要的中藥材種植基地，近年來(lái)，在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)地黃出現(xiàn)大面積葉片焦枯現(xiàn)象，嚴(yán)重影響地黃生長(zhǎng)。據(jù)研究報(bào)道，地黃葉片上存在輪紋病，不同省份病原鑒定結(jié)果存在明顯差異，童曉茹[6]等從山東地黃病葉上分離出葉點(diǎn)霉屬致病菌，解紅娥[7]從山西地黃輪紋病葉上分離得到殼二孢真菌。本研究通過(guò)生物學(xué)、分子生物學(xué)鑒定和柯赫氏法則驗(yàn)證，確定河南溫縣地黃輪紋病的病原物，為明確地黃輪紋病發(fā)病規(guī)律及綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀觀察和病原菌分離

調(diào)查地黃輪紋病的田間發(fā)生情況，觀察其典型癥狀，采集不同發(fā)病期的地黃葉片。用無(wú)菌水沖洗其表面，在病健交界處，切取約5 mm × 5 mm的組織塊，用0.5%的次氯酸鈉溶液清洗1 min，再用無(wú)菌水漂洗3次，濾紙吸干后放于PDA平板(含0.5 μL/mL的96%乳酸的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)上。PDA平板置于霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，溫度設(shè)置為22±2℃，菌絲尖端轉(zhuǎn)接于新的PDA平板純化菌株，獲得單孢株DH20-2，于4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定

在20℃下，PDA上生長(zhǎng)出良好的菌株，記為DH20-2。觀測(cè)記錄菌株生長(zhǎng)情況及菌落的形態(tài)和顏色。在顯微鏡(奧林巴斯BX53)下觀測(cè)、記錄菌株分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征和大小，依據(jù)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行鑒定。

1.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

提取菌株DH20-2基因組DNA，采用CTAB法。對(duì)菌株的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3]。PCR反應(yīng)體系為：上下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL，1 PCR buffer 5 μL，Mg2+(25 mmol/L)3 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA 500 ng，無(wú)菌水補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，pMD19-T載體克隆送至上海生工測(cè)定序列，測(cè)序所得ITS序列，進(jìn)行序列同源性比對(duì)。

1.4 致病性測(cè)定

柯赫氏法則驗(yàn)證，取健康地黃葉片，用酒精和無(wú)菌水清洗葉片表面，晾干。培養(yǎng)5 d，取菌株P(guān)DA平板邊緣，用無(wú)菌打孔器(直徑5 mm)打取瓊脂塊，將有菌絲的一面扣在葉片表面，接種20片葉，同時(shí)接種無(wú)菌PDA平板樣品作為對(duì)照。將葉片置于濕潤(rùn)濾紙的塑料盒中，保濕密封，在20℃下培養(yǎng)，觀察葉片發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

地黃輪紋病在溫縣祥云鎮(zhèn)和夏莊地區(qū)發(fā)病率達(dá)30%。該病發(fā)病初期主要在葉部出現(xiàn)褐色病斑，圓形或近圓形，直徑2～20 mm，病斑呈現(xiàn)明顯輪紋狀(圖1-A)，后期多個(gè)病斑覆蓋葉片表面，導(dǎo)致葉片枯死，易形成穿孔(圖1-B)。田間濕度較大時(shí)，導(dǎo)致地黃大面積葉片枯死，病害嚴(yán)重。

圖1 地黃葉片的病害癥狀

2.2 病原菌形態(tài)學(xué)特征

20℃條件，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)DH20-2菌株，圖2-A中菌落剛開(kāi)始呈白色絮狀，菌絲致密，之后逐漸出現(xiàn)淺粉色，略帶有紫色，約14 d后在菌落表面形成分生孢子梗和分生孢子。挑取培養(yǎng)14 d的菌絲，在顯微鏡下觀測(cè)分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗為瓶梗，小型分生孢子(圖2-B)聚于瓶梗頂端，單孢，無(wú)色，卵型，大型分生孢子鐮刀型，略彎曲。該病原菌與鄭瑞瑞等[8]描述的尖孢鐮刀菌F.oxysporum的形態(tài)特征相似。

圖2 尖孢鐮刀菌的形態(tài)

2.3 分子生物學(xué)鑒定

供試菌株DH20-2的ITS序列，通過(guò)擴(kuò)增、克隆及測(cè)序，得到一條510 bp的片段。在NCBI中，進(jìn)行同源性比對(duì)，該菌株的ITS序列與尖孢鐮刀菌(F.oxysporum，登錄號(hào)KF998987)的同源性達(dá)到99.80%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果(圖3)顯示，菌株DH20-2與F.oxysporum形成一個(gè)明顯的分支；同屬其它真菌也明顯形成分支，每個(gè)分支之間有很高的支持率。綜合病原菌的形態(tài)特征、致病性分析、基因序列同源性比對(duì)以及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，確定河南溫縣地黃輪紋病的病原菌為鐮刀菌屬真菌F.oxysporum。

圖3 基于ITS基因的鐮刀菌種系進(jìn)化樹(shù)

2.4 致病性測(cè)定

在健康地黃葉片上，接種菌絲塊，接種葉片3 d后發(fā)病，發(fā)病率為100%。病斑于接種處向外擴(kuò)延，呈現(xiàn)黑褐色，接種地黃葉片與田間地黃葉片的發(fā)病癥狀相同。PDA瓊脂塊接種的陰性對(duì)照葉片均未發(fā)病(圖4)。再次組織分離純化接種發(fā)病葉片，得到相同病原菌株，證明所接種的菌株為地黃輪紋病的致病菌。

圖4 DH20-2菌株在地黃葉片上的致病性試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

河南省是中藥材大省，地黃為四大懷藥之一，地黃的葉部病害主要為輪紋病，導(dǎo)致地黃葉片枯死，嚴(yán)重時(shí)整株枯死，對(duì)生產(chǎn)造成巨大的損失。本研究從表現(xiàn)輪紋病的地黃葉部分離得到菌株，對(duì)之進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、ITS序列測(cè)序以及同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)病原菌與尖孢鐮刀菌同源性達(dá)到99%以上，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析，初步確定在溫縣地區(qū)地黃輪紋病分離獲得的病原為尖孢鐮刀菌。目前研究表明地黃輪紋病病原多為殼二孢真菌、Phoyllostictadigitalis[9]、AscohytamollerianaWinter[10]等，而由尖孢鐮刀菌引起的地黃輪紋病未見(jiàn)報(bào)道。鐮刀菌引起的多為根部病害[11-13]，引起葉部病害報(bào)道也在增多，尖孢鐮刀菌引起浙江磐安杭白菊葉枯病[14]。廣州地區(qū)因空氣相對(duì)濕度大，由尖孢鐮刀菌引起的金心也門鐵葉斑病愈演愈烈[15]。

本研究中，離體致病性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分離獲得的尖孢鐮刀菌DH20-2菌株能引起離體地黃葉片產(chǎn)生黑褐色壞死癥狀，這表明尖孢鐮刀菌也可能在地黃上引起輪紋病。朱畇昊等[16](2021)從野生地黃中分離內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌，且發(fā)現(xiàn)對(duì)地黃生長(zhǎng)具有促生作用，而本實(shí)驗(yàn)的柯赫氏法則驗(yàn)證，僅做了離體地黃葉片致病性測(cè)定，活體地黃的致病性接種實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步確定。本研究結(jié)果擴(kuò)大了溫縣地區(qū)地黃輪紋病的病原菌類別，為地黃輪紋病的有效防治提供了新的依據(jù)與思路。