繆小兵，張邢松，沈 蓉，朱興華，賈美群

子宮頸癌是常見的婦科腫瘤，通常由持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒引起。子宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)和子宮頸腺癌(cervical adenocarcinoma, CAC)是子宮頸癌最常見的組織學亞型，兩者在致癌突變、免疫微環(huán)境、治療反應和預后等均存在差異[1]。近年，靶向程序性死亡受體-1(programmed death-1, PD-1)/程序性死亡配體-1 (programmed death-ligand 1, PD-L1)通路的免疫檢查點抑制劑，在腫瘤的免疫治療中備受關注[2]。PD-L1通過與活化T細胞表面的PD-1結合，抑制免疫反應。程序性死亡配體-2(programmed death-ligand 2, PD-L2)是PD-1的另一個配體，主要存在于活化的樹突狀細胞和巨噬細胞，在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[3]。目前，PD-L1在子宮頸癌中的表達及作用已有較多報道，但對PD-L2仍知之甚少。本文著重探討CSCC及CAC中腫瘤細胞以及腫瘤浸潤性免疫細胞(tumor-infiltrating immune cell, TIIC)PD-L2的表達及臨床意義，為子宮頸癌的免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2007年12月～2014年8月江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院病理科確診的子宮頸癌石蠟標本161例，其中144例CSCC、17例CAC，并制作成組織芯片?；颊吣挲g29～79歲，中位年齡52歲。入選病例均為手術標本，患者術前均未接受放、化療。

1.2 免疫組化PD-L2一抗(D7U8C，1 ∶200稀釋)購自Cell Signaling Technology公司，二抗及DAB購自DAKO公司。免疫組化染色采用EnVision法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行，用已知陽性組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 判讀標準PD-L2陽性染色定位于細胞膜/細胞質。參考Okadome等[4]的標準，腫瘤細胞 PD-L2判讀按陽性細胞染色強度和陽性細胞百分比進行評分。(1)根據陽性細胞染色強度計分：無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分；(2)根據陽性細胞百分率計分：<10%為0分，10%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分。將兩者得分相乘作為總評分：≥3分為陽性，<3分為陰性。TIIC PD-L2判讀按陽性細胞比例進行判讀：陽性細胞比例≥5%為陽性，<5%為陰性。

1.4 統(tǒng)計學分析采用Pearson χ2、Fisher精確概率法分析腫瘤細胞、TICC PD-L2的表達及與CSCC臨床病理特征的關系。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗。采用Cox風險比例回歸模型進行單因素和多因素預后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 子宮頸癌中PD-L2的表達本組161例子宮頸癌組織中129例CSCC、14例CAC進行PD-L2檢測；另18例因點陣脫落無法進行判讀，包括15例CSCC、3例CAC。腫瘤細胞PD-L2的總陽性率為16.8%(24/143)，TIIC PD-L2的總陽性率為66.4%(95/143)。腫瘤細胞 PD-L2在CSCC中的陽性率為16.3%(21/129)，TIIC PD-L2在CSCC中的陽性率為65.1%(84/129)(圖1、2)。腫瘤細胞 PD-L2在CAC中的陽性率為21.4%(3/14)，TIIC PD-L2在CAC中的陽性率為78.6%(11/14)(表1，圖3、4)。

表1 CSCC及CAC中腫瘤細胞及TIIC PD-L2的表達[n(%)]

2.2 CSCC中PD-L2表達與臨床病理特征的關系腫瘤細胞PD-L2表達與腫瘤浸潤深度有關，其在浸潤深度<1/3纖維肌層(8.2%，5/61)患者中的表達低于浸潤深度達1/3～2/3層(20.7%，6/29)以及>2/3層(25.6%，10/39)患者中的表達(P=0.040)；腫瘤細胞PD-L2表達與患者年齡、脈管侵犯、腫瘤分化、腫瘤直徑、淋巴結轉移以及FIGO分期均無關(P均>0.05)。TIIC PD-L2表達與腫瘤分化相關，其在高+中分化腫瘤(75.0%，42/56)中的表達高于低分化腫瘤(57.5%，42/73)(P=0.039)；TIIC PD-L2表達與患者年齡、脈管侵犯、浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結轉移以及FIGO分期均無關(P均>0.05，表2)。

圖1 CSCC中腫瘤細胞PD-L2呈陽性，EnVision法 圖2 CSCC中腫瘤細胞PD-L2呈陰性，TIIC PD-L2呈陽性，EnVision法 圖3 CAC中腫瘤細胞及TIIC PD-L2均呈陽性，EnVision法 圖4 CAC中腫瘤細胞 PD-L2呈陰性，EnVision法

2.3 PD-L2表達與預后的關系129例CSCC中有完整隨訪資料111例，中位隨訪時間110個月(12～163個月)，其中18例患者出現(xiàn)疾病進展，16例患者死亡。Kaplan-Meier生存分析顯示：腫瘤細胞PD-L2表達與患者無瘤生存期(disease free survival, DFS)和總生存期(overall survival, OS)均無關(P均>0.05)。TIIC PD-L2陽性患者比PD-L2陰性患者的DFS(P=0.007 2)和OS(P=0.011 9)長(圖5)。Cox單因素回歸分析顯示：浸潤深度(P=0.012)、淋巴結轉移(P=0.002)、FIGO分期(P=0.002)以及TIIC PD-L2表達(P=0.011)與DFS相關；脈管侵犯(P=0.039)、浸潤深度(P=0.003)、淋巴結轉移(P=0.001)、FIGO分期(P=0.001)以及TIIC PD-L2表達(P=0.018)與OS相關。Cox多因素分析顯示：FIGO分期(P=0.042)是影響DFS的獨立預后因素；浸潤深度(P=0.021)、FIGO分期(P=0.027)是影響OS的獨立預后因素。TIIC PD-L2是影響DFS和OS的相關因素，但不是獨立的預后因素(P均>0.05，表3)。

表2 CSCC腫瘤細胞及TIIC PD-L2表達與臨床病理特征的關系

表3 Cox單因素和多因素回歸模型分析CSCC患者DFS和OS

3 討論

PD-1又稱為PDCD1、CD279，屬于免疫球蛋白B7-CD28家族成員，在多種免疫細胞(主要是T淋巴細胞)發(fā)現(xiàn)的抑制性受體[5-6]。PD-L1是PD-1的第一配體，由9號染色體上的Cd274基因編碼，在免疫反應中起負性調控作用。PD-L1通過抑制T細胞的免疫活性，逃避免疫監(jiān)視，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。PD-L2又稱為CD273、B7-DC，也是抑制T細胞活化的免疫檢查點通路的關鍵分子。PD-L2是一種I型跨膜蛋白，在其細胞外區(qū)域包含免疫球蛋白可變(immunoglobulin variable, IgV)樣結構域和免疫球蛋白恒定 (immunoglobulin constant, IgC) 樣結構域。PD-L2主要表達于抗原呈遞細胞，包括巨噬細胞和髓樣樹突狀細胞，還可表達于非造血組織，如肺、人臍靜脈內皮細胞以及成纖維細胞[8]。此外，PD-L2還可表達于多種類型的腫瘤細胞[9]。

圖5 CSCC中腫瘤細胞及TIIC PD-L2表達的Kaplan-Meier生存曲線：A.腫瘤細胞PD-L2表達與DFS的關系；B.腫瘤細胞PD-L2表達與OS的關系；C.TIIC PD-L2表達與DFS的關系；D.TIIC PD-L2表達與OS的關系

PD-L1和PD-L2可表達于多種不同的腫瘤細胞及其微環(huán)境細胞，包括TIIC。Rotman等[1]檢測59例子宮頸癌(43例CSCC、14例CAC、2例腺鱗狀細胞癌)中PD-L2的表達，結果顯示：腫瘤細胞PD-L2在子宮頸癌中的總陽性率為53%(31/59)，其中CSCC陽性29例，CAC陽性1例，腺鱗狀細胞癌陽性1例；TIIC PD-L2在子宮頸癌中的總陽性率為39%(23/59)，其中CSCC陽性21例，CAC陽性1例，腺鱗狀細胞癌陽性1例。本組發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞PD-L2的總陽性率為16.8%(24/143)，TIIC PD-L2的總陽性率為66.4%(95/143)。腫瘤細胞PD-L2在CSCC中陽性率為16.3%(21/129)，TIIC PD-L2在CSCC中陽性率為65.1%(84/129)。此外，本組結果還顯示腫瘤細胞PD-L2在CAC中的陽性率為21.4%(3/14)，TIIC PD-L2在CAC中的陽性率為78.6%(11/14)，高于文獻報道；其可能與本組采用組織芯片(由于腫瘤異質性，組織芯片不能代表組織切片全貌)有關。本組CSCC中腫瘤細胞PD-L2表達與CSCC腫瘤浸潤深度有關，其在浸潤深度<1/3纖維肌層患者中的表達顯著低于浸潤深度達1/3～2/3纖維肌層以及>2/3纖維肌層患者(P=0.040)；腫瘤細胞PD-L2表達與患者年齡、脈管侵犯、腫瘤分化、腫瘤直徑、淋巴結轉移以及FIGO分期均無關(P均>0.05)。TIIC PD-L2表達與CSCC腫瘤分化相關，其在高+中分化腫瘤中的表達顯著高于低分化腫瘤(P=0.039)；TIIC PD-L2表達與患者年齡、脈管侵犯、浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結轉移以及FIGO分期均無關(P均>0.05)。

目前，PD-L1和PD-L2在腫瘤中的預后價值仍有爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞PD-L1表達與某些腫瘤的不良預后相關，而TIIC PD-L1表達與OS延長相關。文獻報道子宮頸癌中腫瘤細胞PD-L1表達與OS無關，而TIIC PD-L1陽性原發(fā)性腫瘤患者的OS比PD-L1陰性患者顯著延長[8,10-12]。目前，關于PD-L2對子宮頸癌預后影響的報道較少。本組發(fā)現(xiàn)：腫瘤細胞 PD-L2表達與CSCC患者的DFS和OS均無關(P均>0.05)。TIIC PD-L2陽性患者比PD-L2陰性患者的DFS(P=0.007 2)和OS(P=0.011 9)延長。Cox多因素回歸分析顯示：TIIC PD-L2是影響CSCC患者DFS和OS的相關因素，但不是獨立的預后因素。

綜上所述，CSCC中腫瘤細胞PD-L2表達與腫瘤浸潤深度有關，在浸潤深度局限于淺1/3纖維肌層患者中的表達相對較低；TIIC PD-L2表達與腫瘤分化相關，在高+中分化CSCC中的表達高于低分化CSCC。腫瘤細胞PD-L2表達與CSCC患者的DFS和OS均無關；但CSCC中TIIC PD-L2陽性患者比PD-L2陰性患者的DFS和OS延長。因此，檢測PD-L2表達狀態(tài)可為子宮頸癌的免疫治療提供參考。