余和斌，蒙喜云，郭 勇

(重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科 401220)

膽管癌是起源于膽管上皮的惡性腫瘤，可累及肝內(nèi)、肝門及遠(yuǎn)端膽管樹。目前，膽管癌是僅次于肝細(xì)胞癌的第二大常見肝臟惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，特別是大多數(shù)患者就診時已為中晚期，5年生存率不足30%[1]。近年來研究顯示，由免疫細(xì)胞觸發(fā)的炎癥與腫瘤形成、病情進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)[2]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體是驅(qū)動機(jī)體免疫炎性反應(yīng)的主要機(jī)制，可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)，活化的caspase-1可介導(dǎo)蛋白水解切割和促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的釋放[3]。目前已發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體在炎癥性疾病如糖尿病、動脈粥樣硬化、肝癌等疾病中明顯激活[4-6]，但目前在膽管癌研究較少。本研究通過檢測膽管癌患者NLRP3炎性小體表達(dá)水平，探討其與膽管癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為膽管癌患者的臨床治療提供新的靶點和預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年4月至2018年4月本院收治的行手術(shù)切除治療的142例膽管癌患者的臨床資料，其中男82例，女60例，年齡(59.4±10.4)歲；TNM分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期35例，Ⅲ期45例，Ⅳ期30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)術(shù)后病理確診；(2)診治滿足膽管癌診治指南[7]；(3)未接受過放化療、生物治療及相關(guān)手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在其他膽系疾病；(2)各種急慢性感染；(3)近期使用過激素、免疫抑制劑；(4)存在其他部位惡性腫瘤。另選取40例正常膽管上皮組織作為對照，其中男22例，女18例，年齡(58.6±10.8)歲。對照組與膽管癌組在性別、年齡等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(AM201604102)并征得患者書面知情同意。

1.2 方法

1.2.1實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因mRNA水平

收集研究對象組織樣本，采用RNeasy Tissue Mini試劑盒(美國Qiagen公司)提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海生工公司)從1 μg總的RNA中合成逆轉(zhuǎn)錄cDNA。Sybr-Green和CFX96 Thermal Cycler進(jìn)行實時PCR定量反應(yīng)。反應(yīng)條件及相關(guān)基因(NLRP3和caspase-1)引物參考既往文獻(xiàn)[8]，以GAPDH為內(nèi)參，計算各組相應(yīng)基因的相對表達(dá)量。

1.2.2炎性細(xì)胞因子的檢測

采用ELISA法測定組織上清液IL-1β和IL-18水平，具體操作方法見武漢博士德生物公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3臨床資料收集

收集患者臨床病理資料，包括性別、年齡、TNM分期、組織類型、腫瘤分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及有無脈管侵犯等。

1.2.4隨訪

通過復(fù)診、電話和微信等方式進(jìn)行隨訪，隨訪3年，截止時間為2021年4月，記錄患者生存狀況，分析NLRP3炎性小體表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組NLRP3炎性小體及下游通路指標(biāo)水平比較

與對照組比較，膽管癌組患者組織NLRP3炎性小體和caspase-1 mRNA、 IL-1β及IL-18水平明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 兩組NLRP3炎性小體、caspase-1 mRNA及相關(guān)炎性因子水平比較

2.2 NLRP3炎性小體表達(dá)對患者長期生存狀態(tài)的預(yù)測能力

通過ROC曲線分析膽管癌患者NLRP3炎性小體表達(dá)水平對患者長期生存狀態(tài)的預(yù)測能力，其AUC為0.826(95%CI：0.766～0.887)，確定NLRP3炎性小體的最佳截斷界值為2.61，見圖1。以2.61為界，將142例患者分為低表達(dá)組(84例)和高表達(dá)組(58例)。

圖1 NLRP3炎性小體表達(dá)預(yù)測患者生存狀態(tài)ROC曲線

2.3 NLRP3炎性小體表達(dá)與膽管癌患者臨床病理關(guān)系

NLRP3炎性小體表達(dá)與患者性別、年齡、組織類型等無關(guān)(P>0.05)，與TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管侵犯等有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 NLRP3炎性小體表達(dá)與膽管癌患者臨床病理關(guān)系[n(%)]

2.4 NLRP3炎性小體表達(dá)與膽管癌預(yù)后的關(guān)系

NLRP3炎性小體高表達(dá)患者3年生存率25.86%(15/58)低于NLRP3炎性小體低表達(dá)患者55.95%(47/84)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.95，P<0.001)，見圖2。

續(xù)表2 NLRP3炎性小體表達(dá)與膽管癌患者臨床病理關(guān)系[n(%)]

圖2 Kaplan-Meier生存曲線比較

2.5 膽管癌患者預(yù)后的單因素和多因素Cox回歸分析

單因素分析顯示，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯及NLRP3炎性小體高表達(dá)與膽管癌患者的生存預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，見表3。多因素Cox回歸分析顯示，TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及NLRP3炎性小體高表達(dá)是影響膽管癌患者生存預(yù)后的獨立因素(P<0.05)，見表4。

表3 膽管癌臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表3 膽管癌臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系[n(%)]

表4 Cox多因素回歸分析膽管癌生存預(yù)后的影響因素

3 討 論

膽管癌是一種預(yù)后較差的惡性腫瘤，有報道顯示，即使經(jīng)過根治性肝切除術(shù)，其5年總生存率也不足30%，其主要原因在于術(shù)后復(fù)發(fā)率高，同時缺乏全身有效的治療方案[9]。因此，探尋有效的評估患者病情及預(yù)后的分子指標(biāo)，對于指導(dǎo)膽管癌的治療和改善預(yù)后，具有重要的臨床價值。

既往研究顯示，持續(xù)的炎性反應(yīng)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]。NLRP3炎性小體是炎性反應(yīng)激活的重要通路之一，其廣泛表達(dá)于腫瘤組織和非腫瘤組織中，其激活有賴于Toll樣受體磷酸化，隨后激活核因子-κB(NF-κB)[11]。相關(guān)研究顯示，NLRP3炎性小體除了參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以外，還與糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)，其可作為影響患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的獨立危險因素，同時也可能是上述炎癥性疾病潛在的治療靶點[4-5]。有研究報道，NLRP3炎性小體在正常組織中的表達(dá)水平較低，但在早期胚胎和惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，表明NLRP3炎性小體除了炎性反應(yīng)外，還可能在高等真核生物生長和惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和分化方面，發(fā)揮重要作用[12]。本研究結(jié)果顯示，膽管癌組織NLRP3炎性小體及相關(guān)下游通路指標(biāo)表達(dá)水平明顯高于對照組，提示NLRP3炎性小體可能參與了膽管癌的發(fā)生過程，這與相關(guān)NLRP3炎性小體在肝癌中的研究結(jié)果一致。

NLRP3炎性小體相關(guān)通路的激活可能參與多種腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展[13]。前期有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者及動物模型中NLRP3炎性小體表達(dá)水平明顯上調(diào)，并且其高表達(dá)與乳腺癌轉(zhuǎn)移和生存期相關(guān)[14]。其機(jī)制主要是NLRP3炎性小體激活下游IL-1β，調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)、MMP3和MMP10的表達(dá)，同時IL-1β可激活NF-κB相關(guān)信號，招募單核細(xì)胞進(jìn)入腫瘤局部微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。而敲除或干擾NLRP3炎性小體表達(dá)，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，通過抑制NLRP3炎性小體相關(guān)通路，可能成為乳腺癌治療的重要靶點[16]。NLRP3炎性小體還可介導(dǎo)IL-18的分泌，通過以下途徑抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[17]：(1)誘導(dǎo)和增強(qiáng)NK細(xì)胞對小鼠肝臟及結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的殺傷活性；(2)促進(jìn)IL-22結(jié)合蛋白的下調(diào)，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT3的過度活化和抗凋亡及增殖相關(guān)分子的表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體表達(dá)與膽管癌臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和脈管侵犯有關(guān)，表明NLRP3炎性小體可能在膽管癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體與膽管癌患者臨床預(yù)后有關(guān)，NLRP3炎性小體高表達(dá)的膽管癌患者總生存率較低，多因素Cox回歸分析顯示，NLRP3炎性小體高表達(dá)是影響膽管癌患者生存預(yù)后的獨立因素。

綜上所述，NLRP3炎性小體在膽管癌患者中呈高表達(dá)，其可能與促進(jìn)膽管癌的病理進(jìn)程及多項臨床病理特征相關(guān)，高表達(dá)NLRP3炎性小體預(yù)示更差的臨床預(yù)后和更短的生存期。通過干預(yù)NLRP3炎性小體，有望成為膽管癌的潛在治療靶點，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。