石 赟,陳艷蓉,張 凈,羅 佳

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，北京100050)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以持續(xù)性氣流受限為特征，發(fā)病率逐年升高。影響COPD發(fā)生的因素較多，目前認(rèn)為與遺傳、環(huán)境、吸煙、免疫、慢性炎癥等關(guān)系密切。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3)是NLRPs蛋白家族主要成員之一，已被證實(shí)在COPD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[1]。NLRP3基因多態(tài)性與多種炎性疾病有關(guān)，但與COPD間關(guān)系的研究目前較為缺乏。有研究顯示[2]，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases，GSTs)基因變異是影響COPD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但GSTs基因多態(tài)性與COPD的關(guān)系仍具有一定爭(zhēng)議。文獻(xiàn)指出[3]，Toll樣受體(toll-like receptors 4，TLR4)是天然免疫的重要分子，可識(shí)別內(nèi)外源性病原體，介導(dǎo)炎性反應(yīng)。本研究分析NLRP3、GSTs、TLR4基因多態(tài)性與COPD易感性的關(guān)聯(lián)，為臨床工作提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2021年1月本院收治的131例COPD患者為觀察組，另選取同期健康體檢者120例為對(duì)照。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)COPD患者符合《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南(2018年)》[4]診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床數(shù)據(jù)不完整，對(duì)研究結(jié)果造成影響；(2)合并嚴(yán)重肝、腎功能異常；(3)合并免疫、血液系統(tǒng)疾病、全身感染或惡性腫瘤。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2018-P2-137-01)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)檢測(cè)NLRP3、GSTs、TLR4的基因多態(tài)性。采集所有研究對(duì)象清晨外周靜脈血10 mL，采用酚-氯仿法提取外周血淋巴細(xì)胞中基因組DNA。經(jīng)NanoDrop-2000c(美國(guó)Thermo Scientific公司)檢測(cè)DNA濃度。采用0.2 mL 96孔光學(xué)反應(yīng)板(ABI 7300，美國(guó)Biosystemes公司)對(duì)NLRP3(rs3582941、rs10754558、rs3806265、rs4612666)、GSTs[GSTP1(rs1695)、GSTM1、GSTT1]、TLR4(rs2737190、rs7873784、rs10759932)進(jìn)行基因分型。每微孔中總體積20 μL，通過10 μL MasterMix(ABI 700，美國(guó)Biosystemes公司)、0.5 μL AssayMix(美國(guó)ABI公司)、4.5 μL去離子水及5 μL DNA樣品組成。制備成含有1 000 μL MasterMix、50 μL AssayMix及450 μL去離子水混合物，取15 μL混合物與5 μL DNA樣品加入每個(gè)微孔。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完后使用等位基因辨別程序得到檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組基本資料比較

兩組性別、年齡、飲酒比例、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、尿酸等比較無明顯差異(P>0.05)，觀察組吸煙比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組基本資料比較

組別n舒張壓(x±s,mmHg)空腹血糖(x±s,mmol/L)總膽固醇(x±s,mmol/L)甘油三酯(x±s,mmol/L)尿酸(x±s,μmol/L)對(duì)照組12080.20±8.575.85±1.034.20±0.651.36±0.38386.75±30.69觀察組13181.05±8.786.01±1.104.11±0.681.40±0.40390.65±31.02t/χ20.7751.1871.0720.8111.000P0.4390.2670.2840.4180.318

2.2 基因型及等位基因分布

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，納入研究基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。單位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，NLRP3(rs3806265)、TLR4(rs2737190、rs10759932)基因多態(tài)性與COPD發(fā)病有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 基因型和等位基因分布

2.3 影響COPD發(fā)病的危險(xiǎn)因素分析

吸煙、NLRP3 rs3806265位點(diǎn)、TLR4 rs2737190位點(diǎn)、TLR4 rs10759932位點(diǎn)是COPD發(fā)病的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見表3。

續(xù)表2 基因型和等位基因分布

表3 影響COPD發(fā)病的危險(xiǎn)因素分析

3 討 論

COPD是全球范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率均較高的呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，普遍認(rèn)為與吸煙等行為造成有害顆粒及有害氣體誘導(dǎo)肺部異常炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究顯示吸煙是影響COPD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但臨床數(shù)據(jù)顯示[5]，僅約20%長(zhǎng)期吸煙者最終會(huì)發(fā)展為COPD。提示COPD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不僅與吸煙相關(guān)，還存在一定個(gè)體差異。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示[6]，COPD的發(fā)生具有一定家族聚集性。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明[7]，COPD遺傳學(xué)中發(fā)現(xiàn)許多疾病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)候選基因，如維生素D結(jié)合蛋白基因、基質(zhì)金屬蛋白酶基因、細(xì)胞外超氧化物歧化酶基因等，提示遺傳因素在COPD的發(fā)生中可能占據(jù)重要地位。

已有研究表明[8]，氧化與抗氧化失衡在COPD的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。GSTs是機(jī)體Ⅱ相代謝酶，具備廣泛生物催化特性，通過排除親電子的外源物質(zhì)發(fā)揮抗氧化作用，另外還可以滅活氧化應(yīng)激反應(yīng)形成的次生代謝物，如氫過氧化物、環(huán)氧化合物等。GSTs由至少8個(gè)基因位點(diǎn)編碼，其中GSTP1、GSTT1、GSTM1基因在一般人群中具有基因多態(tài)性，GSTM1與GSTT1基因多態(tài)性表現(xiàn)為缺失，導(dǎo)致酶活性喪失，GSTP1基因多態(tài)性表現(xiàn)為位于105密碼子的異亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸，對(duì)酶催化活性有一定影響[9]。本研究結(jié)果顯示，GSTP1、GSTT1、GSTM1的基因多態(tài)性均與COPD發(fā)病無明顯關(guān)系。

NLRP3基因位于染色體1q44，基因編碼中含有pyrin結(jié)構(gòu)域、核苷酸結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域及富含亮氨酸重復(fù)序列的pyrin樣蛋白，該蛋白是NLRP3炎性體復(fù)合物成員[10]。NLRP3炎性小體已被證實(shí)是核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路上游激活劑，在炎癥、細(xì)胞凋亡及免疫應(yīng)答等反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[11]。另外有研究指出[12]，NLRP3炎性體的激活會(huì)激活半胱天冬蛋白酶-1，后裂解多種白細(xì)胞介素因子并將其釋放，與集體慢性炎癥及癌癥的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。陳幸等[13]研究發(fā)現(xiàn)NLRP3 rs4612666位點(diǎn)基因多態(tài)性與慢性牙周炎易感性關(guān)系密切。劉璐等[14]指出，NLRP3 rs10754558、rs3806268位點(diǎn)基因多態(tài)性與新疆地區(qū)漢族男性痛風(fēng)的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，NLRP3 rs3582941、rs10754558、rs4612666位點(diǎn)基因多態(tài)性與COPD的發(fā)生均無明顯關(guān)聯(lián)。對(duì)照組與觀察組NLRP3 rs3806265位點(diǎn)T基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)多因素分析顯示，NLRP3 rs3806265位點(diǎn)基因多態(tài)性是COPD發(fā)生的獨(dú)立影響因素，與張之海等[15]研究結(jié)論一致。

TLRs家族在樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在機(jī)體炎性免疫應(yīng)答反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。相關(guān)大鼠實(shí)驗(yàn)研究顯示[16]，COPD大鼠模型中TLR4被激活，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活NF-κB 信號(hào)通路中p65，并使其轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與促炎基因的啟動(dòng)子結(jié)合，擴(kuò)增炎性反應(yīng)，造成肺部組織炎性損傷。另有研究表明[17]，COPD患者外周血TLR4水平明顯升高，異常高水平TLR4將激活單核細(xì)胞導(dǎo)致氣道平滑肌細(xì)胞分泌大量炎性因子，推動(dòng)氣道慢性炎癥發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，兩組TLR4 rs2737190位點(diǎn)G、AG、AA及rs10759932位點(diǎn)C、CC、CT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，經(jīng)多因素分析顯示TLR4 rs2737190、rs10759932位點(diǎn)基因多態(tài)性是COPD發(fā)生的獨(dú)立影響因素。

綜上所述，NLRP3 rs3806265位點(diǎn)、TLR4 rs2737190、rs10759932位點(diǎn)基因多態(tài)性影響COPD易感性，是COPD發(fā)病的獨(dú)立影響因素。