強(qiáng)艷，沈振峰，冉航，文明星，屈紅君，顧玉明，胡莉蕓，李明明，劉婷

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

花青素廣泛的存在于被子植物中，是由植物體內(nèi)丙酮途徑生物合成的水溶性多酚類物質(zhì)，具有良好的抗氧化、改善機(jī)體健康、促進(jìn)畜禽生長的功能（Zhao等，2018；Mossalayi等，2014）。前期研究發(fā)現(xiàn)，花青素能夠維持瘤胃內(nèi)環(huán)境平衡，調(diào)控瘤胃發(fā)酵功能和微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)（Tian等，2021；Tian等，2019；Spanghero等，2009）。葡萄籽中花青素含量較高，反芻動物飼料中添加葡萄籽可以改善肉品質(zhì)，增加平均日增重，提高瘤胃pH，調(diào)控瘤胃內(nèi)琥珀酸弧菌屬和普雷沃氏菌屬細(xì)菌相對豐度（Sharifi等，2018；Correddu等，2015；Jeronimo等，2012）。象草（Pennisetum purpureum Schum.）為多年生禾本科暖季型牧草，具有產(chǎn)量高、鮮嫩多汁和適口性好等特點(diǎn)，成為我國南方地區(qū)主要的栽培型牧草。其中，紫色象草中花青素含量為26.60 mg/100 g，是其他象草品種原花青素含量的3 倍以上（鄧素媛等，2021）。但目前鮮有報道關(guān)于紫色象草原花青素對瘤胃發(fā)酵功能和甲烷產(chǎn)量影響的研究?；诖?，本試驗旨在比較相同營養(yǎng)水平下，添加同一水平葡萄籽、紫色象草、葡萄籽和紫色象草混合對體外瘤胃甲烷產(chǎn)量、營養(yǎng)物質(zhì)降解率和瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響，為開發(fā)紫色象草和葡萄籽作為綿羊功能性飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液供體動物和飼料配方 本試驗選擇3只體況良好、體重相似[（36.01± 0.37）kg]的4 月齡大尾寒羊作為瘤胃液供體動物。參照NRC（2007）配制試驗羊全混合日糧（表1）。試驗羊分別在每天07：30、12：30 和18：30 飼喂3次，自由采食和飲水。每天對羊舍進(jìn)行清理，定期進(jìn)行消毒和驅(qū)蟲。

表1 試驗羊全混合飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 試驗設(shè)計 試驗采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計，分為3 個處理組，分別為葡萄籽組（GS 組）、紫色象草組（EG 組）、葡萄籽和紫色象草混合組（GS ×EG 組）。參照NRC（2007）配制等營養(yǎng)水平的全混合飼糧（表2），粉碎過40 mm 篩后作為體外瘤胃發(fā)酵的底物。

表2 全混合飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 體外發(fā)酵試驗 按照Menkede 等（1979）試驗方法配制人工瘤胃緩沖液。試驗羊晨飼前，利用口腔采集器采集3 只供體動物瘤胃液，經(jīng)4 層無菌紗布過濾至39 ℃恒溫并持續(xù)注入CO2厭氧的保溫桶內(nèi)，迅速帶回實(shí)驗室。稱取各處理組飼料（0.2000±0.0020）g 裝入150 mL 的厭氧發(fā)酵罐，置于39.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱3 h后，在每個發(fā)酵罐中加入60 mL 瘤胃人工培養(yǎng)液（體積比=1：2）。參照Wang 等（2016）方法進(jìn)行48 h 體外發(fā)酵試驗，試驗期間向發(fā)酵罐內(nèi)不斷通入CO2，保持試驗環(huán)境在厭氧且恒溫（39.5 ℃）的條件下進(jìn)行。每個樣品每個時間點(diǎn)設(shè)置2 個平行，每個平行3個重復(fù)，同一批次3 個空白對照。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 產(chǎn)氣量及甲烷產(chǎn)量 分別在體外培養(yǎng)3、9、12、24 h 和48 h 時記錄每個發(fā)酵罐連接注射器活塞處的刻度，參照代秦丹等（2021）公式計算各時間點(diǎn)產(chǎn)氣量（GP）。公式如下：

式中：t 為時間點(diǎn)的累計產(chǎn)氣量，mL/g；Vt為t h體外發(fā)酵后樣品注射器活塞處的刻度；V0為t h體外發(fā)酵后空白注射器活塞處的刻度；W0為樣品干物質(zhì)重量，g。

參照Menke 等（1988）研究建立的指數(shù)模型對不同處理相應(yīng)的GP 進(jìn)行非線性回歸擬合，計算相應(yīng)指數(shù)。公式如下：

式中：GPt為t 時間點(diǎn)的累計產(chǎn)氣量，mL/g；B 為最大理論產(chǎn)氣量，mL/g；c 為體外產(chǎn)氣速度，%/h；t 為體外發(fā)酵時間，h；lag 為體外產(chǎn)氣滯流時間，h。

每個時間點(diǎn)利用集氣袋采集注射器內(nèi)的氣體樣品，利用氣相色譜儀（6890N，Agilent，美國）測定甲烷產(chǎn)量，分析測定參考張然等（2018）的方法。公式如下：

式中：CH4產(chǎn)氣量，mL/g；GPt為t 時間點(diǎn)的累計產(chǎn)氣量，mL/g；W 為總產(chǎn)氣量中CH4百分比，%。

1.4.2 不同處理飼料中營養(yǎng)成分的測定 參照AOAC（2006）的方法測定不同處理飼料中干物質(zhì)（DM），粗蛋白質(zhì)（CP）和粗灰分（Ash），中性洗滌纖維（NDF）參考Van Soest 等（1991）的方法測定。

1.4.3 體外發(fā)酵參數(shù)的測定 每個時間點(diǎn)對應(yīng)的發(fā)酵罐結(jié)束發(fā)酵后，使用便攜式酸度計（PHS-3C，上海雷磁，中國）測定發(fā)酵液pH。通過4 層無菌紗布過濾至于10 mL 凍存管保存于-20 ℃冰箱用于測定培養(yǎng)液中的氨態(tài)氮（NH3-N）和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度，其中，發(fā)酵液中NH3-N 濃度利用比色法測定（Broderick 和Kang，1980）；VFA 利用氣相色譜儀（6890N，Agilent，美國）參考Wang 等（2016）的方法分析測定。

1.4.4 發(fā)酵底物營養(yǎng)成分體外降解率的測定

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用Excel 365 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和初步統(tǒng)計后，利用SPSS 23.0 軟件包中的one–way ANOVA 進(jìn)行分析，差異顯著時，采用Tukey 法進(jìn)行多重比較。P <0.05 表示差異顯著，P ≥0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 比較飼糧中添加葡萄籽和紫色象草體外發(fā)酵產(chǎn)氣性能和甲烷產(chǎn)量的差異 各處理GP 隨著體外發(fā)酵時間的推移增加，3～9 h 的GP 增加速度最快（表3）。EG 組體外發(fā)酵9 h 時GP 顯著高于GS × EG 組（P=0.026），發(fā)酵12 h 時GP 顯著高于其他兩個處理組（P=0.044）。體外發(fā)酵24 h和48 h EG 組GP、理論最大產(chǎn)氣量和體外產(chǎn)氣滯流時間均顯著高于GS 組（P=0.031，P=0.019，P=0.038，P=0.045）。由表4 可知，各時間點(diǎn)EG 組甲烷產(chǎn)量均顯著高于其他處理組（P=0.007，P=0.004，P=0.024，P=0.013，P=0.039）。

表3 不同處理各時間點(diǎn)GP以及48 h 產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)

表4 不同處理各時間點(diǎn)甲烷產(chǎn)量 mL/g

2.2 比較飼糧中添加葡萄籽和紫色象草48 h 體外發(fā)酵參數(shù)的差異 由表5 可知，體外發(fā)酵48 h后，EG 組發(fā)酵液pH 為5.88，顯著低于其他兩個處理組（P=0.023），NH3-N 濃度為19.40 mg/100 mL，顯著低于GS 組（P=0.016）。而EG 組發(fā)酵液總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）含量為230.41 mmol/L，顯著高于其他兩個處理組（P <0.001），乙酸摩爾比顯著高于GS 組（P=0.021）。

表5 不同處理48 h 體外發(fā)酵參數(shù)

2.3 比較飼糧中添加葡萄籽和紫色象草48 h 體外發(fā)酵底物降解率的差異 由表6 可知，體外發(fā)酵48 h 結(jié)束后，EG 組發(fā)酵底物體外干物質(zhì)降解率（IVDMD）達(dá)到62.08%，顯著高于其他各處理組（P <0.001），體外有機(jī)物降解率（IVOMD）達(dá)到54.43%，顯著高于GS 組（P=0.034）。

表6 不同處理體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率 %

3 討論

3.1 飼糧中添加葡萄籽和紫色象草體外發(fā)酵產(chǎn)氣性能和甲烷產(chǎn)量的差異 飼糧中碳水化合物和蛋白質(zhì)經(jīng)過瘤胃微生物降解后生成最終產(chǎn)物VFA，在此過程中產(chǎn)生大量的氣體，包括CO2、CH4和H2等。體外發(fā)酵產(chǎn)氣量是反映瘤胃對飼糧的降解程度和瘤胃微生物活性的關(guān)鍵指標(biāo)，且與發(fā)酵底物降解率、微生物活性呈正相關(guān)關(guān)系（Amanullah等，2021；Hassan等，2020；Wang等，2019；Khattab等，2018）。本試驗中EG 組體外發(fā)酵產(chǎn)氣量顯著高于GS組，相對于葡萄籽，紫色象草含有較多的可降解碳水化合物，瘤胃微生物對含有紫色象草的飼料更容易降解。研究表明，飼糧中纖維素和蛋白質(zhì)含量等不易降解成分與體外產(chǎn)氣量呈負(fù)相關(guān)；非結(jié)構(gòu)型碳水化合物含量較高的飼糧在體外發(fā)酵24 h 以內(nèi)便可達(dá)到GP 峰值，而結(jié)構(gòu)型含量較高飼糧的GP 峰值則出現(xiàn)在體外發(fā)酵48 h 之后（Rocha，1992）。本試驗3 個處理組GP 峰值均出現(xiàn)在24 h，由此可以推斷葡萄籽和紫色象草中均含有較多的非結(jié)構(gòu)型碳水化合物，易被微生物快速利用進(jìn)行降解。前期研究證實(shí)，產(chǎn)氣動力學(xué)參數(shù)是衡量反芻動物瘤胃對飼糧碳水化合物降解的重要指標(biāo)（López等，2007；Andrés等，2005）。本試驗中EG 組理論最大產(chǎn)氣量和體外產(chǎn)氣滯流時間顯著高于GS 組。Schofield 等（1994）研究中發(fā)現(xiàn)瘤胃體外發(fā)酵理論最大產(chǎn)氣量與IVNDFD呈正相關(guān)。由此可知紫色象草與葡萄籽相比，含有更多的有效中性洗滌纖維，在瘤胃內(nèi)容易被微生物降解。體外產(chǎn)氣滯流時間能夠反映瘤胃對于飼料中碳水化合物利用的難易程度，體外產(chǎn)氣滯流時間越短，飼料碳水化合物被瘤胃微生物降解的速度越快，且與飼料干物質(zhì)降解率呈正相關(guān)（Wan等，2021；Ma等，2020；He等，2019）。綜上所述，相比葡萄籽，紫色象草含有更多的非結(jié)構(gòu)型碳水化合物，其中的結(jié)構(gòu)型碳水化合物更有利于被瘤胃微生物降解和利用。

反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷是引起飼料能量損失的重要因素，占飼糧總能量的2%～12%（Johnson，1995）。本試驗結(jié)果表明，EG 組各個時間點(diǎn)甲烷產(chǎn)量顯著高于GS 組。相較于葡萄籽，紫色象草中含有瘤胃微生物更易利用的碳水化合物，發(fā)酵產(chǎn)物甲酸通過脫氫酶的作用下生成H2和CO2，其中CO2還原為甲烷；另外甲酸也是產(chǎn)甲烷菌合成甲烷的重要底物，進(jìn)一步提高了甲烷產(chǎn)量。此外，葡萄籽中單寧的含量豐富。Parthasarathi 等（2018）在添加單寧飼料的48 h 體外發(fā)酵試驗中發(fā)現(xiàn)，添加單寧可增加IVDMD，減少甲烷產(chǎn)量。本試驗也得到相似的試驗結(jié)果，GS 組和GS × EG組因葡萄籽中單寧有效的抑制了甲烷產(chǎn)量。反芻動物飼糧中添加含有單寧的飼料能夠有效降低甲烷的排放量，其原因是單寧能夠抑制瘤胃產(chǎn)甲烷菌和原蟲（Pathak等，2017；Bento等，2007）。

3.2 飼糧中添加葡萄籽和紫色象草48 h 體外發(fā)酵參數(shù)的差異 瘤胃pH 是評價瘤胃內(nèi)環(huán)境和發(fā)酵模式的最重要指標(biāo)之一。正常瘤胃內(nèi)pH 為5.50～7.00，且與TVFA 濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（Carro等，2009；Le Ruyet等，1992），本試驗結(jié)果與其相似。謝華德等（2021）和彭婉婉等（2020）利用含有紫色象草和葡萄籽的飼糧作為底物的體外發(fā)酵試驗中也得到了相同的試驗結(jié)果。綜上所述，含有紫色象草和葡萄籽的飼糧體外發(fā)酵期間不會影響瘤胃微生物的增殖和功能。Abarghuei 等（2015）研究表明，在飼糧中添加葡萄渣可顯著升高瘤胃pH。這也可能是造成本試驗結(jié)果中含有葡萄籽飼糧發(fā)酵液pH 高于含有紫色象草飼糧的原因。

瘤胃VFA 是瘤胃微生物發(fā)酵飼糧的最終產(chǎn)物，其中乙酸、丙酸和丁酸的比例占TVFA 含量的95%以上；是反芻動物主要的能量來源，也是瘤胃微生物增殖主要的碳架來源（Wang等，2020；Gray等，1951）。VFA 濃度是衡量飼糧碳水化合物發(fā)酵水平和模式的重要指標(biāo)。本試驗中，EG 組TVFA顯著高于其他兩個處理組，雖然3 個處理組在同一營養(yǎng)水平，但是紫色象草比葡萄籽更容易被瘤胃微生物降解。飼糧組成、水平和來源都是影響VFA 比例和組成的因素（Noziere等，2011；Lane等，2000）。本試驗中，EG 組乙酸摩爾比顯著高于GS 組。發(fā)酵底物中纖維素和半纖維素等結(jié)構(gòu)型碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生較多比例的乙酸，而易發(fā)酵的淀粉等非結(jié)構(gòu)型碳水化合物發(fā)酵后則會產(chǎn)生較高比例的丙酸（Noziere等，2011）。由此可以推斷，紫色象草中含有更多容易被瘤胃微生物降解的結(jié)構(gòu)型碳水化合物。另外乙酸/丙酸是反映瘤胃發(fā)酵類型的重要指標(biāo)，也能從側(cè)面反映瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)，受供體動物品種和飼糧結(jié)構(gòu)的影響，其值 基本在2.0～3.0（張霞等，2019）。本試驗結(jié)果在此范圍內(nèi)，雖然EG 組飼糧在瘤胃內(nèi)有較高的降解率，但本試驗3 個處理組飼糧在同一水平。由此推斷，飼糧營養(yǎng)水平是影響瘤胃乙酸/丙酸主要因素。

瘤胃NH3-N 即是瘤胃微生物分解底物中含氮物質(zhì)的最終產(chǎn)物，也是合成菌體蛋白的主要氮來源。瘤胃NH3-N 濃度在最佳范圍6.58～36.70 mg/100 mL 時適宜瘤胃微生物的增殖（Chen等，2007）。本試驗3 個處理組瘤胃NH3-N 濃度均在這一區(qū)間內(nèi)，表明體外發(fā)酵48 h 內(nèi)發(fā)酵液中微生物菌群處于一個適于生長和增值的環(huán)境內(nèi)。此外，EG 組瘤胃NH3-N 濃度顯著低于GS 組。研究證實(shí)，碳水化合物結(jié)構(gòu)和濃度是限制瘤胃微生物利用瘤胃內(nèi)NH3-N 的主要因素。本試驗中EG 組有較高的產(chǎn)氣量和TVFA 濃度，由此可以推測，EG組48 h 發(fā)酵后瘤胃NH3-N 濃度最低的原因是被瘤胃微生物利用作為合成微生物蛋白原料。此外，da Silva 等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，奶山羊飼料中添加單寧提高了瘤胃內(nèi)NH3-N 濃度，這可能是因為單寧減少了微生物對于飼料蛋白的利用率，從而增加了過瘤胃蛋白的含量。這也是造成本試驗結(jié)果的另一個因素。

3.3 飼糧中添加葡萄籽和紫色象草48 h 體外發(fā)酵底物降解率的差異 飼料降解率是反映飼料碳水化合物被反芻動物降解和利用的一個重要指標(biāo)，飼料可消化營養(yǎng)物質(zhì)越多其營養(yǎng)價值越高。本試驗中EG 組IVDMD 和IVOMD 顯著高于GS組。許蘭嬌等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，苧麻和象草混合青貯飼料的IVDMD 隨著象草比例的增加而升高，這可能是因為象草的木質(zhì)化程度較低，瘤胃微生物能夠降解的結(jié)構(gòu)型碳水化合物含量高引起的。張力莉等（2017）和彭婉婉等（2020）的研究均發(fā)現(xiàn)，添加葡萄籽可降低飼糧IVDMD。這可能是因為葡萄籽中結(jié)構(gòu)型碳水化合物含量較高，降低了瘤胃微生物對其的降解和利用。結(jié)合瘤胃發(fā)酵參數(shù)結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)紫色象草比葡萄籽擁有更高的營養(yǎng)價值。

4 結(jié)論

作為兩種花青素含量較高的非常規(guī)飼料來源，同一營養(yǎng)水平下含有紫色象草的飼糧，具有較高的干物質(zhì)降解率和瘤胃揮發(fā)性脂肪酸含量，提高了瘤胃微生物對氮的利用。在本試驗條件下，紫色象草比葡萄籽擁有更高的營養(yǎng)價值。