郝曉華，鄭凱南，劉可心

（忻州師范學院生物系，山西忻州 034300）

藜麥中完全蛋白含量達到了14%～ 22%（陳思雯，2020），而完全蛋白屬于一類優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其所含氨基酸種類非常多，除了含有9 種必需氨基酸，還含有豐富的非必需氨基酸（李燕青等，2018）。在藜麥中最值得一提的是一般谷物中缺乏的賴氨酸含量非常高，賴氨酸可促進人體組織生長和修復(fù)（王培宇，2020）。作為必需營養(yǎng)元素蛋白質(zhì)是不能被直接吸收的，需要經(jīng)過胃腸道中多種消化酶的作用，將蛋白質(zhì)分解為低分子的多肽或氨基酸后，在小腸內(nèi)被吸收，沿著肝門靜脈進入肝臟（邱友益，2011），并且小分子多肽與單個氨基酸相比，小分子多肽更容易被吸收（李佳，2016）。

研究表明，多肽幾乎參與到人體所有的組織和細胞,從生長、發(fā)育、生殖、代謝甚至到人的情緒控制，因此將其稱為傳遞生命信息的化學使者（尹樂斌等，2021）。小分子活性肽能促進人體激素分泌、促進吸收、調(diào)節(jié)人體免疫能力（高洋等，2017）。多肽如何通過外源性補充幫助人類預(yù)防和治療疾病,改善生理機能，提高生命品質(zhì)，是目前十分重視的課題（劉閃，2014）。張浩玉等（2020）對于酶法制備綠豆多肽的工藝取得了很好的成效，李偉民等（2020）通過尋找新型蛋白資源對于荷葉多肽的制備也有進一步的成果，李可心等（2020）通過改變藜麥培養(yǎng)條件，得到了制備多肽的極好條件，但是目前鮮見利用堿性蛋白酶酶解藜麥芽制備多肽工藝的報道，因此本研究利用堿性蛋白酶酶解藜麥芽制備多肽，確定藜麥多肽的最佳提取條件，為藜麥肽的制備提供理論基礎(chǔ)（尹佳等，2020；姜東，2020；王培宇，2020）。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要儀器 培養(yǎng)皿、酶標儀、可見分光光度計、研缽、離心機、恒溫水浴鍋、電子天平、100 mL容量瓶、移液槍、玻璃棒、冰箱、電磁爐、試管、試管夾、燒杯、10 mL 量筒、錐形瓶、pH 計。

1.1.2 主要試劑 白藜麥芽、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、蒸餾水、氫氧化鈉、氯化氫、堿性蛋白酶、乙醇、磷酸，以上試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解工藝 藜麥芽的培養(yǎng)：先選取50 g 顆粒均勻且飽滿、完整度好的白藜麥種子，用蒸餾水清洗后置于培養(yǎng)皿中，加入清水使其覆蓋過種子即可，等待12 h 后移至覆蓋有一層濾紙和兩層紗布的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)等待種子發(fā)芽。

稱取5 g 白藜麥芽，等分成5組，每組加入一定量的蒸餾水，研磨至粉碎獲得白藜麥芽溶液，在溶液中加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液為堿性，室溫下攪拌3 min，攪拌充分后通過添加氫氧化鈉溶液或氯化氫溶液將溶液pH 微調(diào)至一個固定的pH。

在準備好的溶液中加入一定量的堿性蛋白酶，置于恒溫水浴鍋中，使其在恒定的溫度下反應(yīng)，酶解反應(yīng)結(jié)束后將酶液迅速置于沸水中滅酶15 min。冷卻至室溫后將其在4200 r/min 下離心15 min，棄去沉淀物取上清液。

1.2.2 標準曲線的繪制 將100 mg 的牛血清蛋白溶于蒸餾水中，定容至100 mL，得1 mg/mL 的牛血清蛋白標準溶液，4 ℃下保存。取100 mg 考馬斯亮藍G-250 溶于50 mL 乙醇，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000 mL，濾紙過濾（張浩玉等，2020）。取6 支干凈干燥的試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 和0.7 mL牛血清蛋白標準溶液，用蒸餾水補齊至1 mL，分別加入5 mL 考馬斯亮藍G-250，振蕩使混合均勻，室溫下反應(yīng)3 min，在595 nm 處比色測定。以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標軸上繪制標準曲線，利用標準曲線查出回歸方程。

1.2.3 多肽含量的測定 將試驗收集到的上清液定容到100 mL，搖勻后移取10 mL 溶液到離心管中，以4000 r/min 離心10 min，使上清液澄清，吸取1 mL 上清液，再加入5 mL 考馬斯亮藍G-250溶液混合，以蒸餾水為空白，室溫下反應(yīng)3 min，測定吸光度。根據(jù)標準曲線關(guān)系式，計算多肽含量。

1.2.4 單因素試驗 在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗研究底物濃度、酶添加量、酶解pH、酶解溫度、酶解時間5 個因素對藜麥芽中多肽含量的影響。（1）在底物濃度10%、溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、pH 9.0 的條件下，分別酶解2、3、4、5、6 h，測定多肽含量。（2）在pH 9.0、溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、酶解3 h 條件下，調(diào)節(jié)底物濃度為6%、7%、8%、9%、10%，測定多肽含量。（3）在底物濃度8%、加酶量2000 U/g、pH 9.0，溫度分別為40、45、50、55、60 ℃下酶解3 h，測定多肽含量。（4）在加酶量2000 U/g、底物濃度10%、酶解溫度50 ℃條件下，調(diào)節(jié)pH 分別為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，酶解3 h，測定多肽含量。（5）在溫度50 ℃、底物濃度9%、pH 9.0 的條件下，分別確定酶添加量為1000、1500、2000、2500、3000 U/g 反應(yīng)3 h，測定多肽含量。

1.2.5 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多肽含量為指標，酶解pH、酶添加量、溫度和時間為因素，設(shè)計四因素三水平的正交試驗，優(yōu)化制備藜麥芽多肽的最佳條件（常春等，2021）。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 和Microsoft office 2010 處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線 分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL 牛血清蛋白標準溶液，按1.2.2 的方法測定吸光度。橫坐標為牛血清蛋白濃度x，縱坐標為吸光度y，制作標準曲線見圖1，所得回歸方程為y=0.3043x-0.0044（R2=0.9992）。

圖1 牛血清蛋白標準曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶解時間對多肽含量的影響 由圖2 可知，藜麥芽多肽的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，隨著時間的增加，多肽含量開始緩慢增加，在酶解時間為3 h 時多肽含量達到最大，隨著酶解時間的繼續(xù)增加，多肽含量開始下降，酶解時間6 h時，多肽含量達到最低。產(chǎn)生這個結(jié)果的原因可能是當堿性蛋白酶和底物剛接觸時發(fā)生了快速的酶解反應(yīng)，但是隨酶解時間繼續(xù)延長，多肽受環(huán)境影響分解增加，且隨著酶解時間延長，酶活性逐漸降低，新產(chǎn)生的多肽少于分解的多肽，導致多肽含量整體呈下降趨勢。

圖2 酶解時間對多肽含量的影響

2.2.2 堿性蛋白酶添加量對多肽含量的影響 由圖3 可知，藜麥芽多肽含量隨著堿性蛋白酶添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，隨著堿性蛋白酶的增加，多肽含量增加，在酶添加量達到2000 U/g 的時候最大。可能是因為在有限的底物中酶的增加使反應(yīng)充分發(fā)生，多肽含量增加。達到頂峰后多肽含量逐漸緩慢下降，可能是當酶添加量達到一定量時，在有限的底物中，繼續(xù)增加酶用量不能形成更多的酶底中間復(fù)合物，而大分子之間的位阻效應(yīng)形成了空間障礙抑制了酶促反應(yīng)的進行，或是蛋白質(zhì)的過度水解破壞了肽鍵使多肽含量降低。

圖3 酶添加量對多肽含量的影響

2.2.3 pH 對多肽含量的影響 由圖4 可知，藜麥芽多肽含量隨著pH 的增大依舊呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，pH 增加的同時反應(yīng)速率也在增加，多肽含量也在增加，當pH 到達10.0 的時候，多肽含量達到了最大值，這是因為堿性蛋白酶促作用需要在堿性環(huán)境下進行，隨著堿性的增加酶活性也達到最佳狀態(tài)，而pH 較小不利于堿性蛋白酶的作用，達到峰值后隨pH 的增加多肽含量開始逐漸下降，這是因為蛋白質(zhì)在過酸或者過堿的環(huán)境中結(jié)構(gòu)會受到很大的影響，過堿會導致酶的理化性質(zhì)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進一步使酶活性下降，從而影響酶與底物的結(jié)合，因此多肽含量會下降。

圖4 pH 對多肽含量的影響

2.2.4 底物濃度對多肽含量的影響 由圖5 可知，隨著底物濃度的增加藜麥芽多肽含量呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，說明堿性蛋白酶在底物濃度較低時反應(yīng)緩慢，隨著底物濃度的增加多肽含量增加，底物濃度達到9%的時候，多肽含量達到了最大值，此時的酶解反應(yīng)最為充分。當多肽含量達到最大值之后再繼續(xù)增加底物濃度出現(xiàn)多肽含量降低的情況，可能是由于隨著體系底物蛋白濃度的增加，水解體系中多肽濃度隨之增加，多肽類產(chǎn)物對蛋白酶的反饋抑制作用增強，從而導致水解體系中有效酶活降低。

圖5 底物濃度對多肽含量的影響

2.2.5 酶解溫度對多肽含量的影響 由圖6 可知，隨著酶解溫度的不斷升高，多肽含量出現(xiàn)了先增加后減少的趨勢。在40 ℃的時候含量最低，達到50 ℃后多肽含量達到了最大值，繼續(xù)升高溫度多肽含量開始緩慢下降。這原因可能是溫度較低或較高會抑制酶的活性導致一部分酶失活影響了酶催化效率，每一種酶都有最適溫度，達到最適溫度時酶促反應(yīng)速率最快。所以50 ℃就是堿性蛋白酶酶解藜麥芽制備多肽的最適溫度。

圖6 溫度對多肽含量的影響

2.3 正交試驗優(yōu)化酶解制備工藝 通過對各個單因素試驗結(jié)果的分析，固定底物濃度為9%，選用酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）、酶添加量（D）為自變量，多肽含量為響應(yīng)值，如表1 采用四因素三水平的正交試驗進行優(yōu)化。在表2中，通過對極差R 的分析，極差R 越大表明影響越大，得出影響制備藜麥芽多肽含量的各個因素主次順序為D＞A＞B＞C。因此，酶添加量是對制備多肽影響最大的因素，酶解pH 是對制備多肽影響最小的因素。從正交試驗結(jié)果得出酶解制備多肽的最佳提取方案為A1B2C2D2。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結(jié)果

2.4 驗證試驗 如表3 所示，為驗證正交試驗所得的結(jié)果具有可行性，在上述最佳制備條件下進行3 次平行重復(fù)試驗并測定藜麥芽中制備出來的多肽含量。經(jīng)驗證，藜麥芽中制備出來的多肽含量為（0.4105±0.0021）mg/mL，大于正交試驗分析所得的最大值，表明該制備工藝合理可行。

表3 多肽含量驗證試驗結(jié)果mg/mL

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，各單因素對多肽提取率影響的主次順序為：酶添加量，酶解時間，酶解溫度，酶解pH。結(jié)合正交試驗優(yōu)化堿性蛋白酶酶解法制備藜麥芽多肽的最優(yōu)工藝條件為：酶添加量2000 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解時間3 h，酶解pH 10.0，底物濃度9%。在此條件下多肽含量達到了（0.4105±0.0021）mg/mL。表明該制備工藝穩(wěn)定、可行。