武 瓊， 劉 濤， 魏 兵， 安 然

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院1. 新生兒科；2. 心血管外科，遼寧 沈陽(yáng)110016

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是 一種以左心室或雙心室擴(kuò)大伴心臟收縮功能降低為典型特征的原發(fā)性心肌病，臨床主要表現(xiàn)為慢性心力衰竭、心律失常、附壁血栓形成及心源性猝死。美國(guó)的一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，在歐美人群中，DCM 的年患病率為36.5/10 萬(wàn)人[1]。 近年來(lái)，隨著血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β 受體阻滯劑、植入型心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器和心臟移植等治療措施的不斷應(yīng)用，DCM 患者的生存質(zhì)量不斷改善，但仍有較高的病死率[2-5]。 Haas 等[6]研究報(bào)道，DCM 占所有心力衰竭患者的30% ~40%，是心臟移植的主要原因。DCM 可歸因于遺傳和非遺傳原因，遺傳原因占所有DCM 患者的30% ~50%[6]，常染色體顯性遺傳是主要的遺傳方式。 非遺傳原因包括高血壓、瓣膜疾病、心肌炎、遺傳代謝病和神經(jīng)肌肉疾病等，但這些非遺傳形式的心肌病也可能受個(gè)人遺傳特征的影響。 全外顯子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使人類遺傳學(xué)和基因組學(xué)進(jìn)入臨床研究的新時(shí)代[7]。 本研究采集DCM 心臟移植患者的靜脈血DNA 進(jìn)行全外顯子基因測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)分析，旨在探索與DCM 發(fā)生密切相關(guān)的突變基因，并分析其與臨床特征的相關(guān)性。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析自2016 年9 月至2020 年9 月就診于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心血管外科的6 例DCM 心臟移植患者的臨床資料。 患者均符合《中國(guó)擴(kuò)張型心肌病診斷和治療指南》[8]中DCM 的診斷標(biāo)準(zhǔn)。 6 例患者的一般資料見表1。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫審K(2020)29 號(hào)]。

表1 6 例患者一般資料

1.2 全外顯子測(cè)序 采集患者靜脈血約2 ml，經(jīng)EDTA 抗凝，離心后于-80℃冰箱保存，高通量測(cè)序法進(jìn)行全外顯子基因測(cè)序。 使用DNA 血液檢測(cè)試劑盒提取血液DNA。 通過(guò)1%瓊脂凝膠電泳評(píng)估DNA 的降解程度以及是否有RNA、蛋白質(zhì)污染，進(jìn)而評(píng)估DNA 的完整性。 對(duì)所有DNA 樣本進(jìn)行定量，總量＞250 ng 可用來(lái)建庫(kù)。 將DNA 隨機(jī)剪切到200 bp 的平均片段大小，使用AMPureXP 磁珠提純碎片以除去小產(chǎn)物。 片段化后的DNA 經(jīng)過(guò)3 個(gè)酶解步驟:末端修復(fù)、A-拖尾和與Illumina 成對(duì)末端索引接頭的連接，通過(guò)PCR 擴(kuò)增進(jìn)行樣本標(biāo)記并富集DNA，用Qubit 2.0 熒光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。將帶有生物素標(biāo)記的RNA 探針與特異片段文庫(kù)進(jìn)行液相雜交，再通過(guò)帶有鏈酶親和素標(biāo)記的磁珠獲取目標(biāo)基因外顯子，進(jìn)而用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行目標(biāo)基因的富集。 測(cè)量DNA 濃度，文庫(kù)濃度＞25 ng/μl 參考為合格文庫(kù)。 使用Agilent 的2100 生物分析儀分析捕獲的文庫(kù)，文庫(kù)主峰在220 ~320 bp，主峰前后無(wú)雜峰。 文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit 3.0 進(jìn)行定量，然后用NovaSeq 6000 平臺(tái)進(jìn)行PE150 測(cè)序，產(chǎn)生2 ×150 bp 的成對(duì)末端讀數(shù)。

1.3 生物信息學(xué)分析 使用GATK 分析基因突變位點(diǎn)，并用ANNOVAR 注釋。 在CLNDN、HGMD_Phenotype、KEGG、OMIN_disease、HPO、HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選關(guān)鍵詞“DCM”，將發(fā)現(xiàn)的致病基因位點(diǎn)與其進(jìn)行比對(duì)。 通過(guò)千人基因組 2015 年版(1000g2015aug)、 ExAC 數(shù) 據(jù) 庫(kù)、 gnomAD exome人群基因突變頻率數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，保留“未收錄”及人群突變頻率≤0.05 的突變。 采用GERP ＋＋RS 軟件對(duì)核苷酸序列進(jìn)行保守性分析，分值＞2 代表突變基因位點(diǎn)具有保守性，分值越高表明核酸的保守性越高。 采用Mutation Taster、Fathmm MKL 在線預(yù)測(cè)軟件及CADD 評(píng)分評(píng)估蛋白質(zhì)的致病性。 Mutation Taster 用于預(yù)測(cè)內(nèi)含子和非同義突變、移碼突變對(duì)基因功能的影響，分值越大結(jié)果越可靠，預(yù)測(cè)結(jié)果取值為D:Disease causing(有害)；N:Polymorphism(無(wú)害)。 Fathmm MKL 軟件的預(yù)測(cè)分值越小越有害，預(yù)測(cè)結(jié)果取值為D:Deleterious(有害)；T:Tolerated(無(wú)害)。 采用CADD 評(píng)分評(píng)估單核苷酸位點(diǎn)突變的有害性，CADD 值越高，該突變位點(diǎn)是一個(gè)有害突變的概率越高，CADD 分值＞15 為有害突變。 應(yīng)用InterVar 軟件對(duì)篩選的基因突變位點(diǎn)進(jìn)行美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)評(píng)級(jí)。

2 結(jié)果

2.1 全外顯子測(cè)序結(jié)果 全外顯子測(cè)序共篩選出3 個(gè)與DCM 相關(guān)的基因突變位點(diǎn)。 (1) 患者2 發(fā)現(xiàn)PSEN2 基因在chr1:227078985 位置發(fā)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的第298 號(hào)氨基酸由蛋氨酸變異為蘇氨酸。 (2)患者3 發(fā)現(xiàn)MYBPC3 基因在chr11:47364625 位置發(fā)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的第433 號(hào)氨基酸由丙氨酸變異為甘氨酸。 (3)患者4 發(fā)現(xiàn)LMNA 基因在chr1:156104248 位置發(fā)生錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的第190 號(hào)氨基酸由精氨酸變異為色氨酸。 見表2。

2.2 突變位點(diǎn)致病性評(píng)估結(jié)果 LMNA 及MYBPC3 基因突變位點(diǎn)在人群突變數(shù)據(jù)庫(kù)中為未收錄位點(diǎn)，PSEN2 基因突變位點(diǎn)在人群數(shù)據(jù)庫(kù)中的最高突變頻率為0.000 008 15。 經(jīng)GERP ＋＋RS 軟件預(yù)測(cè)，3 個(gè)突變基因位點(diǎn)均具有保守性。 經(jīng)Mutation Taster 軟件、Fathmm-MKL 軟件預(yù)測(cè)及CADD 評(píng)分，3 個(gè)基因突變位點(diǎn)均具有致病性。 經(jīng)ACMG 評(píng)級(jí)，LMNA Arg190Trp 突變?yōu)榭赡苤虏〉耐蛔?，MYBPC3 Ala433Gly 突變及PSEN2 Met298Thr 突變?yōu)榕R床意義未明的突變。 見表3。

表2 篩選基因突變位點(diǎn)的具體信息

表3 基因突變位點(diǎn)突變頻率及在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

分子遺傳學(xué)研究表明，基因突變與DCM 發(fā)病機(jī)制、臨床表型及預(yù)后等高度相關(guān)[9]。 目前研究發(fā)現(xiàn)，有40 多個(gè)基因與DCM 相關(guān)，這些基因分別編碼細(xì)胞骨架、心肌結(jié)構(gòu)蛋白、離子通道蛋白、線粒體和RNA 結(jié)合蛋白等[10]。 LMNA 基因突變是家族性DCM 的第二大常見病因，發(fā)生于5% ~13%的特發(fā)性DCM 患者中[11]。 LMNA 基因編碼的核纖層蛋白A 和C，可以維持細(xì)胞核核膜的穩(wěn)定及核孔的形成，在肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)的連接中起機(jī)械傳導(dǎo)的作用[12]。 功能研究表明，與野生型蛋白相比，LMNA 變異體改變了蛋白的粘彈性，降解速率更快，并形成了更多的蛋白質(zhì)聚集體[13-14]。 該突變位點(diǎn)ACMG 評(píng)級(jí)為可能致病的突變(致病證據(jù):PM1 ＋PM2 ＋PP3 ＋PP5)，在ClinVar 網(wǎng)站中被報(bào)告為致病性突變(變異ID:66908)。

LMNA 基因突變的患者常在未診斷DCM 前便出現(xiàn)了有癥狀的傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病或心律失常，診斷DCM 后常伴有嚴(yán)重心力衰竭、左室壁血栓形成或心源性猝死，但心源性猝死的患者一般伴有輕微的收縮功能障礙或無(wú)收縮功能障礙[15]。 因此，歐洲心臟病學(xué)會(huì)指南建議，對(duì)于具有LMNA 突變的DCM患者，即使心臟收縮功能正常，也應(yīng)考慮植入型心律轉(zhuǎn)復(fù)除顫器治療(Ⅱa 類推薦)[16]。 本研究中，LMNA 基因突變患者伴有心房顫動(dòng)及右束支傳導(dǎo)阻滯，心功能較差，在38 歲接受了心臟移植手術(shù)，這與現(xiàn)有的LMNA 基因型與DCM 臨床表型相關(guān)的研究結(jié)論相符，且患者父親具有心臟擴(kuò)大病史，不能排除家族性DCM 的可能。 有研究報(bào)道，LMNA相關(guān)的DCM 患者表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的外顯率，70 歲時(shí)外顯率可達(dá)90% ~95%[15]，因此建議患者家系成員進(jìn)行該基因位點(diǎn)的篩查，對(duì)無(wú)癥狀基因突變攜帶者的心臟功能進(jìn)行長(zhǎng)期的隨訪篩查。

MYBPC3 基因編碼的心肌肌球蛋白結(jié)合蛋白C，在肌節(jié)A 帶中橫向排列，在粗肌絲中結(jié)合肌球蛋白重鏈，在細(xì)肌絲中結(jié)合肌動(dòng)蛋白，該蛋白的磷酸化對(duì)于心肌肌節(jié)的收縮起調(diào)節(jié)作用。 MYBPC3基因突變與DCM 相關(guān)研究較少，多在肥厚性心肌病家系中被報(bào)道。 Daehmlow 等[17]報(bào)道了1 例DCM男性患者的MYBPC3 錯(cuò)義突變(Asn948Thr)。 本研究發(fā)現(xiàn)了 1 例新的 MYBPC3 錯(cuò)義突變(Ala433Gly)，ACMG 評(píng)級(jí)為臨床意義未明的突變(致病證據(jù):PM1 ＋PM2 ＋PP3)，需進(jìn)一步獲取患者家系成員的基因位點(diǎn)信息以提升ACMG 評(píng)級(jí)的證據(jù)等級(jí)。 目前尚缺乏MYBPC3 基因突變與DCM 臨床表型相關(guān)聯(lián)的研究，僅有Dhandapany 等[18]分析了南亞人群心肌病患者M(jìn)YBPC3 基因中25 bp 的缺失，確定了MYBPC3 基因突變與心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。 而本研究中MYBPC3 基因突變患者心力衰竭癥狀較重，在接受心臟起搏器治療后心功能難以維持，最終接受心臟移植治療。

PSEN2 編碼早老素2，是影響γ-分泌酶活性的重要決定因素，負(fù)責(zé)淀粉樣前體蛋白和NOTCH 受體蛋白的蛋白水解切割，被證實(shí)為3 型阿爾茲海默病的突變基因。 Li 等[19]對(duì)315 例DCM 患者的PSEN1 和PSEN2 基因序列進(jìn)行了評(píng)估，在兩個(gè)DCM 家系分別中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的PSEN1 錯(cuò)義突變(Asp333Gly)和一個(gè)PSEN2 錯(cuò)義突變(Ser130Leu)，并證實(shí)來(lái)自PSEN1 和PSEN2 突變攜帶者的成纖維細(xì)胞中的鈣信號(hào)發(fā)生了改變。 而本研究發(fā)現(xiàn)了1 例新的PSEN2 錯(cuò)義突變(Met298Thr)，ACMG 評(píng)級(jí)為臨床意義未明的突變(致病證據(jù):PM1 ＋PM2 ＋PP3)。 由于目前對(duì)于PSEN2 基因與DCM 的相關(guān)研究較少，仍需大樣本的臨床研究及功能驗(yàn)證進(jìn)一步得到更準(zhǔn)確的結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了1 例DCM 的熱點(diǎn)突變LMNA Arg190Trp，2 例臨床意義未明的基因突變位點(diǎn)MYBPC3 Ala433Gly 及PSEN2 Met298Thr，需要進(jìn)一步對(duì)患者家系成員進(jìn)行基因篩查，同時(shí)進(jìn)行功能試驗(yàn)，對(duì)基因位點(diǎn)的致病性進(jìn)行驗(yàn)證。