董麗榮，李忠榮，邱明華

（1 昆明市食品藥品檢驗所檢驗研究中心 云南 昆明 650100）

（2 中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室 云南 昆明 650201）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var. officinalis（Dode）Huang 或疏毛吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang干燥的近成熟果實，是常用的中藥。其藥性辛、苦，熱，有小毒。歸肝、脾、胃、腎經。其功效主要為散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉。吳茱萸屬（Evodia）植物，約150 種，分布于亞洲、非洲東部及大洋洲。我國有約20 種5 變種，除東北北部及西北部少數(shù)省區(qū)外，各地均有分布。吳茱萸主要含有喹啉酮生物堿和吲哚生物堿，檸檬苦素三萜，月桂烯等揮發(fā)油成分。吳茱萸生物堿具有強心、抗菌、鎮(zhèn)痛消炎、減肥、支氣管收縮、增加組織器官血流量、抗血栓，抑制血小板收縮，舒張血管、保護胃黏膜、肝門括約肌松弛、抑制腫瘤等藥理作用；檸檬苦素類化合物具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、神經保護、護肝等作用；吳茱萸揮發(fā)油具有鎮(zhèn)痛、抗菌、促進交感神經腎上腺機能等作用。

為更好地開發(fā)利用吳茱萸屬植物資源，對購自昆明菊花村中藥材市場的吳茱萸藥材的化學成分進行研究，分離鑒定了羥基吳茱萸堿（hydroxyevodiamine）、吳茱萸次堿（rutaecarpine）、吳茱萸堿（evodiamine）、吳茱萸果酰胺-I（wuzhuyuamide-I）4 個生物堿類化合物，并對4 個生物堿的抗腫瘤活性進行了研究。

1.儀器和材料

質譜儀為VG AutoSpec 3000 型；H-NMR、C-NMR譜由Bruker AM-400 型磁共振儀測定，TMS 為內標；柱色譜用硅膠（200 ～300 目）及TLC 硅膠板均購自青島海洋化工廠；其余試劑除注明外均為分析純。旋轉蒸發(fā)儀：EYELA SB-2000（Japan）。吳茱萸果實于購自昆明菊花村藥材市場，經鑒定為Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth 的果實。

2.提取與分離

（1）將干燥的9.5 kg 吳茱萸果實粉碎后，用石油醚（60 ℃～90 ℃）浸泡2 d，濾除石油醚液，晾干溶劑，藥渣再用甲醇回流提取3 次，合并提取液，濃縮后懸浮于水中，加濃鹽酸調PH 值至2，充分攪拌，靜止，倒出上清液，上清液以乙酸乙酯萃取3 次，萃取后的溶液用氫氧化鈉調PH 值至9，用氯仿萃取3 次，得粗生物堿部分54 g。（2）粗生物堿部分與150 g 硅膠拌樣，經硅膠柱色譜分離，用氯仿-甲醇系統(tǒng)（30:1，20:1，10:1，5:1，2:1）進行梯度洗脫，每250 mL 作為1 個流份，共收集22 個流份，（30:1）洗脫得流份1 ～7，（20:1）洗脫得流份8 ～15；（10:1）洗脫得流份15 ～18，（5:1）洗脫得流份18 ～20，（2:1）洗脫得流份21、22。流份2，3 經反復硅膠柱層析，純化得到化合物2（15 mg）和4（8 mg），流份8 ～13 經反復硅膠柱層析及凝膠純化氯仿重結晶得化合物3，流份6 ～20 中析出黃色結晶，過濾結晶，甲醇少量多次洗滌后，經氯仿重結晶，得到化合物1（4.5 g）流份21、22 中析出黃色粉末，經甲醇重結晶，得到化合物4（7 mg）。

3.結構鑒定

3.1 化合物1

黃色片晶（氯仿），易溶于氯仿、丙酮。H-NMR（CDCl，400 MHz）δ：9.96（1 H，br s,-OH），7.61（1 H，d，J = 8.0 H z，H-19），7.46（1 H，d，J = 8.0 H z，H-17），7.36（1 H，t，J = 8.0 Hz，H-16），7.23（1 H，d，J = 7.2 Hz，H-18），7.15（1 H，d，J = 8.5 Hz，H-9），6.99（1 H，d，J = 8.5 Hz，H-12），6.79（1 H，dt，J = 8.5 Hz，H-11），6.51（1 H，t，J = 8.5 Hz，H-10），4.19（2 H，t，J = 6.4 H z，H-5），3.20（2 H，d，J = 6.4 H z，H-6）；C-NMR（CDCl，100 MHz）δ：126.0（C-2），162.1（C-3），47.5（C-5），20.5（C-6），122.8（C-7），124.6（C-8），120.5（C-9），120.5（C-10），126.0（C-11），113.1（C-12），138.5（C-13），150.9（C-15），111.0（C-16），134.5（C-17），114.6（C-18），132.4（C-19），115.8（C-20），175.8（C-21），29.8（-CH）。以上數(shù)據與唐元清等報道對照基本一致，故鑒定化合物1 為羥基吳茱萸堿（Hydroxyevodiamine）。

3.2 化合物2

白色針晶（氯仿），紫外光下呈藍色熒光，碘化鉍鉀反應陽性，易溶于氯仿、丙酮。H-NMR（CDCl，400 MHz）δ：9.26（1 H，s，N-H），8.31（1 H，d，J = 7.8 Hz，H-19），7.71（1 H，dd，J = 6.8，8.3 Hz，H-17），7.64（1 H，d，J = 8.3 H z，H-16），7.62（1 H，dd，J = 6.8，7.6 Hz，H-18），7.42（1 H，d，J = 7.8 Hz，H-9），7.33（1 H，d，J = 7.3 Hz，H-12），7.18（1 H，dd，J = 6.8，7.3 Hz，H-11），7.16（1 H，d，J = 7.6 H z，H-10），4.58（2 H，d，J = 6.8 H z，H-5），3.23（2 H，d，J = 6.8 Hz，H-6）；C-NMR（CDCl，100 MHz）δ：126.7（C-2），144.8（C-3），41.0（C-5），19.6（C-6），118.3（C-7），125.6（C-8），120.6（C-9），120.1（C-10），125.6（C-11），112.0（C-12），138.3（C-13），147.5（C-15），126.6（C-16），134.3（C-17），125.6（C-18），126.2（C-19），121.1（C-20），161.6（C-21）。H NMR 及C-NMR 數(shù)據和與趙超等報道對照基本一致，故鑒定化合物2 為吳茱萸堿次堿（rutaecarpine）。

3.3 化合物3

白色疏松粉末（氯仿），可溶于氯仿、丙酮。H-NMR（CDN，500 MHz）δ：8.71（1 H，S，N-H），8.41（1 H，d，J = 7.5 H z，H-19），7.71（1 H，d，J = 7.5 H z，H-17），7.60（1 H，t，J = 7.5 Hz，H-16），7.33（1 H，d，J = 7.1 Hz，H-18），7.28（1 H，d，J = 8.0 Hz，H-9），7.18（1 H，d，J = 8.0 Hz，H-12），7.11（1 H，dt，J = 8.0 Hz，H-11），7.02（1 H，t，J = 8.0 Hz，H-10），6.06（1 H，3，H-13），5.06（2 H，t，J = 6.4 Hz，H-5），3.53（2 H，t，J = 6.4 Hz，H-6），2.84（3 H，s，N-CH）；C-NMR（CDN，120 MHz）δ：130.3（C-2），69.9（C-3），40.6（C-5），20.4（C-6），112.8（C-7），127.2（C-8），119.7（C-9），120.6（C-10），122.9（C-11），112.2（C-12），138.1（C-13），150.7（C-15），119.2（C-16），133.4（C-17），122.8（C-18），129.2（C-19），122.6（C-20），164.9（C-21），36.7（-C H）。H NMR 及C-NMR 數(shù)據和與唐元清等報道對照基本一致，故鑒定化合物3 為吳茱萸堿（evodiamine）。

3.4 化合物4

白色針晶（氯仿：甲醇），氯仿、甲醇均不易溶。H-NMR（CDN，500 MHz）δ：11.60（1 H，s，N-H），8.27（1 H，d，J = 7.8 H z，H-19），7.78（1 H，d，J = 7.8 Hz，H-17）7.53（1 H，d，J = 7.5 Hz，H-9），7.20（1 H，dd，J = 7.8 Hz，H-12），7.12（1 H，t，J = 7.5 Hz，H-11），7.05（1 H，t，J = 7.5 Hz，H-10），7.02（1 H，t，J = 6.5 H z，H-18），6.92（1 H，d，J = 7.8 H z，H-16），5.00（1 H，br s，7-OH），4.85（1 H，m，Ha-5），4.75（1 H，m，Hb-5），3.37（3 H，s，N-CH），2.91（1 H，m，Ha-6），2.82（1 H，m，Hb-6）；C-NMR（CDN，125 MHz）δ：178.6（C-2），150.9（C-3），37.6（C-5），36.4（C-6），75.8（C-7），133.4（C-8），124.9（C-9），122.2（C-10），129.4（C-11），110.3（C-12），143.0（C-13），141.0（C-15），114.2（C-16），135.0（C-17），122.7（C-18），128.6（C-19），116.0（C-20），161.7（C-21），30.5（-CH）。以 上數(shù)據與楊秀偉等報道對照基本一致，故鑒定化合物4為吳茱萸堿果酰胺-I（wuzhuyuamide-I）。

4.腫瘤細胞株生長抑制活性測試

MTT 全稱為3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-zy1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide，是一種黃色染料。活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，同時在細胞色素C 的作用下，生成藍色（或藍紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的含量可以用酶標儀在570 nm 處進行測定。在通常情況下，甲臜生成量與活細胞數(shù)成正比，因此可根據光密度OD 值推測出活細胞的數(shù)目。

4.1 接種細胞

用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液（DMEM 或者RMPI1640）配成單個細胞懸液，以每孔10 000 ～20 000 個細胞接種到96 孔板，每孔體積100 μL，貼壁細胞提前12 h 接種培養(yǎng)。加入待測化合物溶液，固定濃度40 μM 初篩，在該濃度對腫瘤細胞生長抑制在50%附近的化合物設5 個濃度進入梯度復篩，每孔終體積200 μL，每種處理均設3 個復孔。

4.2 顯色

37 ℃培養(yǎng)48 h 后，每孔加MTT 溶液20 μL。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液100 μL 以避免細胞丟失，每孔加20%的SDS 100 μL，過夜孵育（溫度37 ℃），使結晶物充分融解。

4.3 比色

選擇595 nm 波長，酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio-Rad 680）讀取各孔光吸收值，記錄結果，以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，應用兩點法（Reed and Muench 法）計算化合物的IC（μm）值，見表1。

表1 化合物對不同腫瘤細胞株的半數(shù)生長抑制濃度IC50（μm）

5.討論

本文報道了4 個吳茱萸生物堿類化合物的提取分離方法，并以順鉑和紫杉醇作為對照，測試了吳茱萸生物堿類化合物對白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌5 種腫瘤細胞的生長抑制活性，結果顯示，化合物吳茱萸次堿和吳茱萸堿具有較為顯著的體外腫瘤生長抑制活性，與對照物順鉑的抑制作用相當或強于順鉑。

吳茱萸堿抗腫瘤作用機理為抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、引起細胞核轉錄因子易位、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移。關于吳茱萸次堿的抗癌活性的研究報道較少，有待深入研究。