馮漢青，王娟娟，達(dá)曉偉，楊德麗，龐海龍

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

磷作為植物所需的常量元素，是維持植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[1].自然界中植物所需的磷通常以磷酸鹽形式存在.由于磷是核酸、磷脂類等物質(zhì)的構(gòu)成元素，因此無(wú)論是自然界的植物還是體外培養(yǎng)的植物組織或細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中均需要較大的磷酸鹽供給以維持基本的生長(zhǎng)和發(fā)育[2].

磷源供應(yīng)水平的變化能夠引起細(xì)胞的多種生理學(xué)反應(yīng)[3].研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞磷供應(yīng)量決定著核酸、蛋白質(zhì)、花色苷、苯丙素、花青素等初級(jí)和次級(jí)代謝物的合成水平[4-5].另有研究揭示，環(huán)境中可攝取磷酸鹽量減少時(shí)會(huì)明顯影響細(xì)胞呼吸途徑[6]、糖酵解途徑的運(yùn)行，并影響到植酸酶、抗氧化酶、酸性磷酸酶等植物代謝相關(guān)酶的活性[7-8].

三磷酸腺苷(ATP)主要在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，是生物體內(nèi)的“能量貨幣”.而最近的研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物、植物以及微生物細(xì)胞均可以將細(xì)胞內(nèi)ATP通過(guò)多種方式釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，使得細(xì)胞外也存在著一定水平的ATP，即胞外ATP(eATP)[9].對(duì)動(dòng)物細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，胞外ATP可以結(jié)合跨膜受體蛋白，作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)及免疫等生理過(guò)程[10-11].胞外ATP也是植物中重要的信號(hào)分子[12]，調(diào)控了植物細(xì)胞活性氧(ROS)及鈣離子的水平、生長(zhǎng)發(fā)育、防御相關(guān)基因表達(dá)以及植物對(duì)于逆境的響應(yīng)等[13-14].另有研究報(bào)道，胞外ATP過(guò)多的積累以及胞外ATP的去除均能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，說(shuō)明胞外ATP的動(dòng)態(tài)平衡在植物細(xì)胞活性的調(diào)控中也扮演著重要的角色[15].因此，基于胞外ATP的上述功能，外源ATP可以作為調(diào)控劑影響植物的多種生理學(xué)反應(yīng).

如上所述，磷酸鹽的供應(yīng)會(huì)影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)和生理學(xué)狀態(tài)[16-17].但目前為止，在缺磷及正常磷供應(yīng)下外源ATP對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和活性氧代謝的影響以及差異尚不明確.故文中以煙草懸浮細(xì)胞為材料，探討了在缺磷及正常磷供應(yīng)下胞外ATP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和抗氧化性能的影響，以期進(jìn)一步為胞外ATP調(diào)控植物生長(zhǎng)和抗氧化代謝的機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用煙草懸浮細(xì)胞(NicotianatabacumL.cv.Bright Yellow-2)由香港中文大學(xué)姜里文教授饋贈(zèng).將煙草懸浮細(xì)胞在Murashige-Skoog(MS)液體培養(yǎng)基(添加3%(W/V)蔗糖和0.2 mg·L-1的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))中接種，于27 ℃,130 r·min-1黑暗條件下振蕩培養(yǎng).每隔一個(gè)生長(zhǎng)周期(7 d)吸取10 mL細(xì)胞培養(yǎng)物，加入到200 mL新鮮的MS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代.吸取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(第4 d)的煙草懸浮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行處理，所有步驟均在無(wú)菌條件下進(jìn)行.

1.2 煙草懸浮細(xì)胞的處理

取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(第4 d)的煙草懸浮細(xì)胞.用金屬網(wǎng)篩過(guò)濾后，稱取2 g細(xì)胞(鮮重)用去離子水洗滌2次后分別進(jìn)行如下處理：將上述煙草懸浮細(xì)胞分別加入到缺磷MS培養(yǎng)(不含KH2PO4)、標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基(含1.25 mmol·L-1KH2PO4)、添加外源ATP(30 μmol·L-1)的缺磷MS培養(yǎng)基和添加外源ATP(30 μmol·L-1)的標(biāo)準(zhǔn)MS培養(yǎng)基.所有處理濃度均為細(xì)胞懸浮液中的終濃度，終體積為20 mL.將上述不同培養(yǎng)基下生長(zhǎng)的細(xì)胞在27 ℃黑暗條件下振蕩培養(yǎng)72 h.

1.3 H2O2的測(cè)定

H2O2含量采用硫酸鈦法測(cè)定[18].稱取0.2 g細(xì)胞，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷丙酮，冰浴研磨成勻漿，于4 ℃,10 000 r·min-1離心10 min；取0.7 mL上清液并加入0.1 mL 5%硫酸鈦和0.2 mL濃氨水，在4 ℃,10 000 r·min-1下離心10 min.棄上清后用1 mL 2 mol·L-1濃硫酸溶解沉淀，在OD415處測(cè)定吸光度.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2O2含量.

1.4 細(xì)胞活力測(cè)定

細(xì)胞活力采用伊文思藍(lán)法測(cè)定[19].稱取0.2 g細(xì)胞，加入1 mL磷酸緩沖液搖勻后，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.025% 的伊文思藍(lán)染液0.1 mL，染色8 min.3 000 r·min-1下離心3 min 棄上清，再次加入1 mL 的磷酸緩沖液，于3 000 r·min-1下離心3 min棄上清. 多次重復(fù)此步驟以洗去未結(jié)合細(xì)胞的伊文思藍(lán).對(duì)清洗后的細(xì)胞加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的十二烷基磺酸鈉溶液(溶劑為體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇)，混勻后于50 ℃下水浴30 min，使細(xì)胞裂解，并于10000 r·min-1下離心10 min,取0.5 mL上清液，用蒸餾水稀釋至3 mL，在OD595處檢測(cè)吸光值.

1.5 細(xì)胞鮮重測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，充分搖起錐形瓶中的細(xì)胞，用金屬網(wǎng)篩濾去培養(yǎng)基，利用電子天平稱量細(xì)胞，得細(xì)胞鮮重.

1.6 超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的測(cè)定

1)酶液提取.稱取0.2 g煙草懸浮細(xì)胞于預(yù)冷研缽中，加入預(yù)冷磷酸緩沖液(0.05 mol·L-1pH=7.8)及少許石英砂，充分研磨后加入緩沖液至終體積為1 mL.于4 ℃,10 000 r·min-1離心10 min.取上清即為待測(cè)粗酶液.

2)POD活性用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[20].POD酶活性以O(shè)D470每分鐘變化0.01為一個(gè)酶活單位(U).SOD活性測(cè)定用NBT光化學(xué)還原法[21]，SOD酶活性以抑制NBT光化學(xué)還原的50%為一個(gè)酶活單位(U).CAT活性測(cè)定用紫外吸收法[22]，CAT 酶活性以O(shè)D240每分鐘變化0.1為一個(gè)酶活單位(U).

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得結(jié)果為至少3次實(shí)驗(yàn)的平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用雙總體t檢驗(yàn)，在P<0.05水平上具有差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 缺磷及正常磷供應(yīng)下外源ATP對(duì)煙草懸浮細(xì)胞活性和生長(zhǎng)的影響

結(jié)果顯示，缺磷下生長(zhǎng)的煙草細(xì)胞活性是正常磷供應(yīng)下細(xì)胞活性的1.2倍.對(duì)于缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞分別加入外源ATP后發(fā)現(xiàn)，外源ATP使得缺磷下細(xì)胞的活性降低了13%，但外源ATP使得正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞活性升高了10%(效果未達(dá)到顯著性水平, 圖1(a)).

測(cè)定細(xì)胞的鮮重發(fā)現(xiàn)，正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞的鮮重是缺磷下的1.2倍.對(duì)于缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞分別加入外源ATP后發(fā)現(xiàn)，外源ATP使缺磷下的細(xì)胞鮮重增加了1.5倍，而正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞鮮重增加了1.3倍(圖1(b)).

注：-P,缺磷供應(yīng)；+P,正常磷供應(yīng)；CK,未進(jìn)行外源ATP處理的細(xì)胞；ATP,進(jìn)行外源ATP處理的細(xì)胞.不同字母表示在P<0.05水平上具有顯著性差異，下同.

2.2 缺磷及正常磷供應(yīng)下外源ATP對(duì)煙草懸浮細(xì)胞H2O2水平的影響

通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞H2O2含量發(fā)現(xiàn)，正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞H2O2含量是缺磷下生長(zhǎng)細(xì)胞H2O2含量的3.8倍.對(duì)缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞分別添加外源ATP，結(jié)果顯示外源ATP使缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞中H2O2含量顯著性升高了28%，而使正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞中的H2O2含量顯著降低了23%(圖2).

2.3 缺磷及正常磷供應(yīng)下外源ATP對(duì)煙草懸浮細(xì)胞POD、SOD、CAT活性的影響

缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞的POD活性是正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)細(xì)胞POD活性的7.5倍.分別對(duì)缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞添加外源ATP，發(fā)現(xiàn)外源ATP使得缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞的POD活性顯著性降低了60.2%，而使正常磷供應(yīng)下細(xì)胞POD活性顯著性上升了7.4倍(圖3(a)).

圖2 不同處理下BY-2煙草懸浮細(xì)胞H2O2含量的變化

SOD活性測(cè)定結(jié)果顯示，缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞的SOD活性略高于正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞，但未達(dá)到顯著性差異.添加外源ATP使得缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞SOD活性均有所下降(圖3(b))，但均未達(dá)到顯著水平.

CAT活性測(cè)定結(jié)果顯示，缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞的CAT活性是正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)細(xì)胞的1.6倍.外源ATP使缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞的CAT酶活性顯著性上升了2.5倍，而使正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)細(xì)胞的CAT活性顯著性上升了3倍(圖3(c)).

圖3 不同處理下POD,SOD,CAT活性的變化

2.4 外源ATP對(duì)攝磷煙草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和活性氧代謝影響分析

如圖4，較之細(xì)胞的活力，細(xì)胞的鮮重對(duì)外源ATP更加敏感；而在活性氧代謝過(guò)程中，較之細(xì)胞SOD活性，細(xì)胞的H2O2含量、POD活性以及CAT活性對(duì)外源ATP更加敏感.對(duì)于缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞，外源ATP對(duì)于細(xì)胞鮮重、SOD活性以及CAT活性具有相似的影響；而外源ATP對(duì)于細(xì)胞活力、H2O2含量、POD活性則具有相反的影響；其中，外源ATP對(duì)POD活性的影響最為明顯.

圖4 外源ATP對(duì)攝磷細(xì)胞生長(zhǎng)和活性氧代謝的影響趨勢(shì)

3 討論

作為一種大量營(yíng)養(yǎng)元素，環(huán)境中磷素的供應(yīng)影響著植物的生長(zhǎng)狀態(tài)和代謝水平[23].本研究發(fā)現(xiàn)，較之缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞，正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞活性降低但鮮重增加.說(shuō)明在有磷酸鹽供應(yīng)時(shí)，伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞膜會(huì)產(chǎn)生一定的損傷.

研究表明，外源磷的缺乏能夠限制細(xì)胞的分裂[27-28].因此，正常磷供應(yīng)下細(xì)胞鮮重的增加可能是磷供應(yīng)刺激細(xì)胞分裂的結(jié)果.另有研究發(fā)現(xiàn)，在磷酸鹽濃度較低時(shí)，細(xì)胞膜表面質(zhì)子泵不會(huì)被激活；而當(dāng)有磷酸鹽攝入時(shí)，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生酸化以刺激質(zhì)子泵運(yùn)輸磷[24]；而細(xì)胞質(zhì)酸化被認(rèn)為能夠增加膜的透性和細(xì)胞損傷[25-26].因此，文中認(rèn)為在正常磷供應(yīng)下細(xì)胞出現(xiàn)的損傷應(yīng)當(dāng)為細(xì)胞加速吸收和運(yùn)輸磷過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)發(fā)生酸化所致.

對(duì)比缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞對(duì)外源ATP的反應(yīng)(圖4a-b)發(fā)現(xiàn)，外源ATP能夠促進(jìn)兩種細(xì)胞鮮重的增長(zhǎng)，并顯著降低了缺磷生長(zhǎng)下細(xì)胞的活性.盡管植物細(xì)胞無(wú)法直接吸收外源ATP，但細(xì)胞外ATP受體蛋白或三磷酸腺苷雙磷酸酶可感受胞外ATP或水解細(xì)胞外ATP產(chǎn)生磷酸鹽[29].據(jù)此推測(cè)，外源ATP增加了細(xì)胞磷酸鹽的供給，由此增加了細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng).而對(duì)于缺磷生長(zhǎng)的細(xì)胞而言，外源ATP使得細(xì)胞膜表面質(zhì)子泵從非激活狀態(tài)轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)明顯的酸化和較為明顯的細(xì)胞損傷.

進(jìn)一步研究揭示，較之缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞，正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞H2O2水平顯著上升.Hannah等也發(fā)現(xiàn)低磷會(huì)導(dǎo)致煙草懸浮細(xì)胞ROS水平降低[30].另有研究揭示，缺磷會(huì)增加植物抗氧化酶的基因表達(dá)和活性[32-36].因此，缺磷下細(xì)胞活性氧含量的變化應(yīng)當(dāng)和抗氧化酶的變化有關(guān).文中通過(guò)測(cè)定抗氧化酶發(fā)現(xiàn)，正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞POD、SOD、CAT活性均低于缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞，其中POD的活性降低最為顯著.據(jù)此推測(cè)，POD活性的降低是導(dǎo)致正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)細(xì)胞H2O2水平上升的主要原因.

早期在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外ATP可以誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生.繼而在植物中也發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外ATP能夠上調(diào)ROS的產(chǎn)生[37].有趣的是，外源ATP也可以誘導(dǎo)采后農(nóng)作物抗氧化酶活性的提高，以緩解ROS積累所導(dǎo)致的采后農(nóng)作物衰老[39].因此，細(xì)胞外ATP對(duì)植物細(xì)胞ROS代謝的調(diào)控尚有一定的爭(zhēng)議.

文中也繼而研究了外源ATP對(duì)缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞ROS代謝的影響.結(jié)果顯示，對(duì)于兩種細(xì)胞，外源ATP均增加了CAT和SOD的活性；但外源ATP對(duì)H2O2水平和POD的活性具有相反的作用(圖4(c)～(f))：對(duì)于缺磷下生長(zhǎng)的細(xì)胞，ATP降低了H2O2水平，但增加了POD的活性；對(duì)于正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞，ATP增加了H2O2水平，但降低了POD的活性.這一方面提示，POD活性的變化是決定缺磷及正常磷供應(yīng)下生長(zhǎng)的細(xì)胞H2O2水平變化的主要原因；另一方面則表明，外源ATP對(duì)于植物細(xì)胞H2O2的調(diào)節(jié)作用和細(xì)胞磷酸鹽的供給水平有關(guān)：在正常磷供應(yīng)下，外源ATP能夠通過(guò)下調(diào)POD的活性而增加H2O2的產(chǎn)生；而在缺磷狀態(tài)下，外源ATP能夠通過(guò)上調(diào)POD的活性而降低H2O2的產(chǎn)生.這可能解答了目前對(duì)于細(xì)胞外ATP對(duì)植物細(xì)胞活性氧代謝調(diào)控作用的爭(zhēng)議：對(duì)于在磷供應(yīng)正常下生長(zhǎng)的植物，外源ATP能夠促進(jìn)H2O2的產(chǎn)生；而對(duì)于采后的農(nóng)作物，由于已經(jīng)無(wú)法從環(huán)境中攝取磷酸鹽，外源ATP則表現(xiàn)為抑制H2O2的產(chǎn)生.

綜上所述，在缺磷及正常磷供應(yīng)下外源ATP能調(diào)節(jié)細(xì)胞攝磷過(guò)程中細(xì)胞的生長(zhǎng)和ROS代謝，且其調(diào)控作用和細(xì)胞的磷源供應(yīng)有關(guān).