牛世全，趙 進(jìn)，樊子婧，孫銘悅

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

當(dāng)歸(Angelicasinensis)屬傘形科[1]，為藥用草本植物，其干燥根是享譽(yù)世界的植物藥材之一[2].據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血等功效，常被中醫(yī)用于治療貧血、月經(jīng)不調(diào)等婦科疾病，還可作為日常補(bǔ)品食用[3-5].我國當(dāng)歸產(chǎn)地主要分布在甘肅東南部、四川及云南等地，甘肅岷縣因其得天獨(dú)厚的自然條件優(yōu)勢而被譽(yù)為“千年藥鄉(xiāng)”，其所產(chǎn)的當(dāng)歸品質(zhì)優(yōu)良，又被稱為岷歸[6-7].然而隨著耕作年限的增加，土壤可溶性養(yǎng)分含量不斷下降，土傳病害(主要以真菌為主，如鐮刀菌、腐霉菌等)發(fā)病率不斷上升，嚴(yán)重破壞了當(dāng)歸種植區(qū)土壤生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致當(dāng)歸品質(zhì)和產(chǎn)量下滑，制約了當(dāng)歸產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[8].

土壤微生物通過調(diào)節(jié)土壤功能來維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，是影響植物健康生長的關(guān)鍵因素之一[9-10]，不同土壤之間、或同一土壤類型的不同田地之間，微生物群落組成都存在明顯差異[11].根際細(xì)菌群落多樣性因在調(diào)節(jié)土壤肥力、固氮、生產(chǎn)激素、養(yǎng)分分配以及抑制植物病害發(fā)生等方面都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因而被作為評估土壤質(zhì)量和肥力的重要生物指標(biāo)[12-13].已有研究表明，增加根際土壤細(xì)菌多樣性，可以提高土壤中脲酶和磷酸酶的活性，降低當(dāng)歸發(fā)病率[14].此外，根際微生物群落結(jié)構(gòu)還與土壤養(yǎng)分含量密切相關(guān)[15].根際微生物的生長繁殖需要從環(huán)境中獲取所需營養(yǎng)物質(zhì)，研究微生物介導(dǎo)的根際土壤養(yǎng)分循環(huán)過程，以及土壤理化因子與微生物群落的關(guān)系，有助于明確土壤養(yǎng)分的主要驅(qū)動(dòng)因素，以減少外界對植物健康生長的干擾[16].有研究證實(shí)，適當(dāng)?shù)母淖兏H微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能，可以改善土壤養(yǎng)分含量,促進(jìn)植物吸收利用，提高當(dāng)歸品質(zhì)[17].可見，了解植物根際細(xì)菌群落多樣性、結(jié)構(gòu)組成、影響因素和功能等，對于土壤微生物生態(tài)學(xué)研究具有重要意義[18].

本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)，分析岷縣當(dāng)歸種植區(qū)不同連作年限根際土壤與休耕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，揭示土壤細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，并運(yùn)用PICRUSt2算法預(yù)測土壤細(xì)菌群落的基因功能，期望為探明甘肅岷縣當(dāng)歸種植區(qū)不同連作年限根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，防止病害發(fā)生及當(dāng)歸種植區(qū)土壤修復(fù)提供一定的技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況及樣點(diǎn)設(shè)計(jì)

甘肅省定西市岷縣閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸種植區(qū)(104°37′42″E， 34°21′18″N， 海拔2785.39 m)氣候高寒，年均氣溫較低(約4.4 ℃)，年降水量較高(約640 mm)，屬典型的高原性大陸氣候，無霜期為101 d，春秋相連，土壤類型為黑土，土層深厚，適宜當(dāng)歸生長.

樣點(diǎn)設(shè)計(jì)：根據(jù)種植區(qū)實(shí)地調(diào)查，當(dāng)歸幼苗在4月份移栽前，均一次性施入足量基肥(腐熟農(nóng)家肥每畝3 800 kg，配化學(xué)肥料(磷酸二銨每畝20 kg、硫酸鉀每畝10 kg和尿素每畝10 kg)).試驗(yàn)共設(shè)計(jì)5個(gè)取樣點(diǎn)，以荒置多年未耕作的土壤為休耕地土壤CK_J，種植當(dāng)歸1年的耕地為根際土壤F1，種植當(dāng)歸2年的耕地為根際土壤F2，種植當(dāng)歸3年的耕地為根際土壤F3，種植當(dāng)歸5年的耕地為根際土壤F4.

1.2 土壤樣品采集

于2020年10月進(jìn)行土壤樣品采集.F1～F4采用5點(diǎn)采樣法在每個(gè)取樣點(diǎn)(重復(fù)3次)隨機(jī)選擇5株大小相近的當(dāng)歸，整株挖出后收集根須周圍的土壤作為根際土樣[19]；CK_J采用5點(diǎn)采樣法，收集5～20 cm的土壤，每個(gè)樣地3個(gè)重復(fù).將采集后的土樣低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，每組土樣過2 mm篩后分成2份，一份保存在-80 ℃冰箱用于測序，另一份自然風(fēng)干后測定理化性質(zhì).

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

測定的土壤理化性質(zhì)包括pH、電導(dǎo)率(EC)、有機(jī)質(zhì)(SOM)、全氮(TN)、速效磷(AP)、速效鉀(AK).pH值使用筆式pH計(jì)測定，EC使用筆式電導(dǎo)率儀測定，SOM測定采用重鉻酸鉀容量法—稀釋熱法，TN測定采用凱氏定氮法，AP測定采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗分光光度法，AK測定采用四苯硼鈉比濁法[20].

1.4 土壤總DNA的提取、擴(kuò)增和測序

將每個(gè)樣點(diǎn)的15份土樣等量混合后，使用E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross, GA, USA)提取土壤總DNA.利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量.土壤細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增，采用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴(kuò)增V3-V4 可變區(qū).擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)(95 ℃ 變性30 s， 55 ℃ 退火30 s, 72 ℃ 延伸30 s)，最后72 ℃延伸 10 min(PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型).

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測.QuantiFluorTM-ST(Promega, USA)進(jìn)行檢測定量.根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)(Illumina, San Diego, USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300的文庫，在Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序，測序由深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司完成.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用 Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 25.0 軟件 Duncan’s 法進(jìn)行單因素方差分析.Origin 2021分析土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分布，R 4.1.2軟件進(jìn)行土壤細(xì)菌主坐標(biāo)分析(PCoA)；Canoco 5.0進(jìn)行冗余分析(RDA)，TBtools對土壤細(xì)菌群落的預(yù)測功能進(jìn)行聚類分析,并繪制熱圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 當(dāng)歸種植區(qū)土壤理化性質(zhì)

岷縣閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸種植區(qū)土壤均呈堿性，pH值波動(dòng)較小，大致范圍在7.6～8.2，隨連作年限的增加根際土壤pH值增高.土壤其他理化指標(biāo)變化規(guī)律則各不相同，電導(dǎo)率在各樣本間差異顯著(P<0.05)，休耕地土壤顯著高于根際土壤；速效磷含量根際土壤中顯著高于休耕地土壤；速效鉀含量在休耕地土壤中顯著高于根際土壤；全氮含量在根際土壤中顯著高于休耕地土壤；有機(jī)質(zhì)含量則在兩者間差異不顯著.隨連作年限的增加，速效磷、速效鉀和全氮含量差異顯著(P<0.05,表1).

表1 當(dāng)歸種植區(qū)土壤理化性質(zhì)

2.2 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的Alpha多樣性分析

細(xì)菌群落多樣性指數(shù)(Alpha-Diversity)中，Chao1 指數(shù)代表物種群落豐富度；Shannon指數(shù)代表物種群落多樣性.由表2可知，根際土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性均高于休耕地土壤.隨著連作年限的增加，當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性均呈先降低后增加的趨勢.

2.3 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌主坐標(biāo)分析

基于Bray Curtis距離進(jìn)行PCoA分析，并選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合進(jìn)行作圖，可以說明各土壤樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間存在的差異大小，圖中各土壤樣本的距離越接近，表示樣本之間的細(xì)菌物種組成結(jié)構(gòu)越相似.如圖1所示，第一主成分軸和第二主成分軸分別解釋細(xì)菌群落總變異的36.7%和30.0%，共解釋了原信息量的66.7%；且與休耕地土壤CK_J細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似度由近到遠(yuǎn)依次為F1,F2,F3,F4.

表2 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)

圖1 土壤細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析圖(PCoA)

2.4 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌群落組成

2.4.1 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌門水平群落組成分析甘肅岷縣閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸種植區(qū)5個(gè)土壤樣點(diǎn)共注釋到28個(gè)門、74個(gè)綱、102個(gè)目、153個(gè)科和174個(gè)屬.其中相對豐度排名前10的優(yōu)勢菌門分別為(圖2)：放線菌門(Actinobacteria, 根際土壤26.8%～46.3%，休耕地土壤39.3%)、變形菌門(Proteobacteria, 根際土壤18.1%～25.3%，休耕地土壤21.4%)、綠彎菌門(Chloroflexi, 根際土壤11.1%～14.1%，休耕地土壤12.8%)、厚壁菌門(Firmicutes, 根際土壤9.2%～12.2%，休耕地土壤11.1%)、酸桿菌門(Acidobacteria, 根際土壤8.8%～19.9%，休耕地土壤6.2%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(根際土壤1.1%～2.3%，休耕地土壤3.9%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes, 根際土壤1.5%～2.3%，休耕地土壤2.2%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae, 根際土壤1.6%～2.3%，休耕地土壤1.7%)、未分類(Unclassified)和其他.其中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和厚壁菌門的相對豐度之和，在連作和休耕地土壤中均大于70%，為主要優(yōu)勢菌門.放線菌門的相對豐度隨連作年限的增加而降低，酸桿菌門(Acidobacteria)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對豐度隨連作年限的增加而增加，變形菌門和厚壁菌門的相對豐度隨連作年限的變化呈先增加后降低的趨勢.

2.4.2 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌屬水平群落組成分析當(dāng)歸連作根際土壤和休耕地土壤分別包含92和113個(gè)細(xì)菌屬.將相對豐度排名前20的細(xì)菌屬繪圖(圖3)發(fā)現(xiàn)，根際土壤中相對豐度較高的細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus，4.3%～7.3%)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter，2.0%～3.3%)、分支桿菌屬(Mycobacterium，1.0%～2.6%)、紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes，1.0%～2.1%)、Kaistobacter(0.9%～1.4%)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium，0.6%～1.0%)、拜納蒙納斯屬(Balneimonas，0.5%～1.3%)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira，0.5%～1.1%)；休耕地土壤中相對豐度較高的細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬(3.6%)、節(jié)桿菌屬(2.7%)、棒桿菌屬(Corynebacterium，2.0%)、藤黃單胞菌屬(Luteimonas，1.7%)、紅球菌屬(Rhodococcus，1.5%)、檸檬球菌屬(Citricoccus，1.1%)、紅游動(dòng)菌屬(1.1%)，說明屬水平下，當(dāng)歸連作根際和休耕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相差較大.芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬為共有的優(yōu)勢菌屬.連作根際土壤中芽孢桿菌屬相對豐度均高于休耕地土壤.

圖2 當(dāng)歸根際和休耕地土壤細(xì)菌門水平前10的 相對豐度

圖3 當(dāng)歸根際和休耕地土壤細(xì)菌屬水平 前20的相對豐度

2.5 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門與土壤理化因子的RDA分析

通過DCA分析發(fā)現(xiàn)，Lengths of gradient第一軸小于3.5，因此選擇 RDA分析土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門和理化因子的相關(guān)性，調(diào)整后的方差解釋度為96.1%(圖4)，結(jié)果顯示土壤pH、電導(dǎo)率和全氮含量對土壤優(yōu)勢菌門影響較大.相對豐度與酸堿度呈正相關(guān)的菌門有：硝化螺旋菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門和變形菌門；相對豐度與酸堿度呈負(fù)相關(guān)的菌門有：放線菌門和厚壁菌門.相對豐度與電導(dǎo)率呈正相關(guān)的菌門有：放線菌門、厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門；相對豐度與電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)的菌門有：芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、綠彎菌門和酸桿菌門.放線菌門相對豐度與全氮含量呈正相關(guān)，其余優(yōu)勢菌門相豐度與全氮含量為負(fù)相關(guān).

橫軸為RDA1，即第一軸解釋了數(shù)據(jù)方差變化的82.65%；縱軸為RDA2，即第二軸解釋了數(shù)據(jù)方差變化的16.37%.

2.6 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌屬與土壤理化因子的RDA分析

通過DCA分析發(fā)現(xiàn)，Lengths of gradient第一軸小于3.5，因此選擇 RDA分析土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌屬和理化因子的相關(guān)性，調(diào)整后的方差解釋度為91.4%(圖5)，結(jié)果顯示土壤pH、速效磷和全氮含量對細(xì)菌優(yōu)勢菌屬影響較大.相對豐度與酸堿度呈正相關(guān)的菌屬有：Kaistobacter、拜納蒙納斯屬、節(jié)桿菌屬、硝化螺旋菌屬、Turicibacter、生絲微菌屬、紅球菌屬和芽孢八疊球菌屬；呈負(fù)相關(guān)的菌屬有：芽孢桿菌屬、紅游動(dòng)菌屬、分支桿菌屬和慢生根瘤菌屬.相對豐度與速效磷含量呈正相關(guān)的菌屬有：拜納蒙納斯屬、Kaistobacter、慢生根瘤菌屬、分支桿菌屬、紅游動(dòng)菌屬和芽孢桿菌屬；呈負(fù)相關(guān)的菌屬有：Turicibacter、生絲微菌屬、芽孢八疊球菌屬、紅球菌屬、藤黃單孢菌屬、棒桿菌屬、檸檬球菌屬、梭菌屬、迪茨氏菌屬和Proteiniclasticum.相對豐度與全氮含量呈正相關(guān)的菌屬有：拜納蒙納斯屬、Kaistobacter、分支桿菌屬、慢生根瘤菌屬、紅游動(dòng)菌屬和芽孢桿菌屬；呈負(fù)相關(guān)的菌屬有：節(jié)桿菌屬、硝化螺旋菌屬、Turicibacter、生絲微菌屬、芽孢八疊球菌屬、紅球菌屬、藤黃單孢菌屬、棒桿菌屬、檸檬球菌屬、梭菌屬、迪茨氏菌屬和Proteiniclasticum.

橫軸為RDA1，即第一軸解釋了數(shù)據(jù)方差變化的70.60%；縱軸為RDA2，即第二軸解釋了數(shù)據(jù)方差變化的19.89%.

2.7 當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌PICRUSt2功能預(yù)測

PICRUSt2的原理是基于已測微生物基因組的序列，將測序得到的微生物組成映射到數(shù)據(jù)庫中，對微生物功能進(jìn)行預(yù)測[21-22].預(yù)測結(jié)果顯示，在KEGG pathway LV1層級(jí)下，有6類代謝通路包括代謝、遺傳信息處理、細(xì)胞過程、人類疾病、有機(jī)體系和環(huán)境信息處理.在KEGG pathway LV2層級(jí)下，共發(fā)現(xiàn)47個(gè)二級(jí)功能.在KEGG pathway LV3層級(jí)下，共發(fā)現(xiàn)384個(gè)三級(jí)功能.相對豐度排名前20的三級(jí)預(yù)測功能(圖6)，主要對應(yīng)輔助因子和維生素的代謝、碳水化合物代謝、糖的生物合成與代謝、翻譯、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞生長與死亡等二級(jí)功能層.結(jié)果表明，當(dāng)歸根際土壤與休耕地土壤細(xì)菌群落基因功能相對豐度明顯不同，且隨著連作年限的增加，當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落基因功能相對豐度呈增高的趨勢.其中，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、三羧酸循環(huán)的相對豐度在CK_J中最高；酮體的合成與降解、萜類化合物和類固醇的合成、泛酸和輔酶A生物合成以及肽聚糖的生物合成的相對豐度在F1中最高；細(xì)菌趨化性和生物素代謝的相對豐對在F2中最高；D-丙氨酸代謝和細(xì)胞周期-柄桿菌屬的相對豐度在F3中最高；蛋白質(zhì)輸出、脂肪酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成的相對豐度在F4中最高.

圖6 土壤細(xì)菌群落預(yù)測功能基因三級(jí)功能層熱圖

3 結(jié)果與討論

甘肅岷縣閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸種植區(qū)，不同連作年限當(dāng)歸根際與休耕地土壤細(xì)菌群落多樣性存在差異，根際土壤中細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)均高于休耕地土壤，這是因?yàn)楫?dāng)歸生長過程中根系分泌產(chǎn)生大量營養(yǎng)物質(zhì)有利于根際土壤細(xì)菌的繁殖[23]，即植物根際土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的含量影響土壤細(xì)菌豐富度和多樣性，這一結(jié)果在其他植物根際土壤微生物群落研究中也得到了證實(shí)[24-26].高曉梅等[27]研究根腐病脅迫下韭菜根際細(xì)菌多樣性的變化發(fā)現(xiàn)，通過對3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(健康組H、 輕度發(fā)病組RI和重度發(fā)病組Rh)根際細(xì)菌多樣性的測定，結(jié)果表明2個(gè)發(fā)病組的細(xì)菌多樣性均高于健康組，且RI的細(xì)菌多樣性最高，推測可能是病原菌在侵染初期不具有優(yōu)勢性，植物根際會(huì)進(jìn)行自身防御，根系分泌產(chǎn)生各類具有防御性能的化感物質(zhì)，吸引各類細(xì)菌共同防御病原菌的侵染.隨著連作年限的增加，閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌多樣性呈先降低后增加的趨勢，且連作土壤 F4中細(xì)菌多樣性最高.

植物在生長過程中根際會(huì)與土壤環(huán)境形成特定的植物-土壤-微生物生態(tài)系統(tǒng)，其中根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征是該生態(tài)系統(tǒng)的決定因素之一[28].門水平下，閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸連作根際土壤和休耕地土壤細(xì)菌群落中，主要優(yōu)勢菌門包括放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門和酸桿菌門等，其中放線菌門為最優(yōu)勢菌群，這一結(jié)果與前人研究當(dāng)歸根際微生物多樣性的結(jié)果相似[29]，放線菌門在干旱半干旱區(qū)中的分布較廣，許多菌屬具有耐鹽堿、耐旱等特性，在鹽堿地土壤中能夠較好的定殖[30-31].已有研究表明，放線菌門不僅可以降解土壤中的農(nóng)藥殘留，協(xié)助修復(fù)土壤環(huán)境的污染[32-33]；還能夠分解土壤有機(jī)質(zhì)促進(jìn)碳循環(huán)，幫助植物生長[34-35].本研究中，當(dāng)歸連作根際土壤F1放線菌門的相對豐度高于休耕地土壤，推測可能是連作時(shí)間較短，土壤環(huán)境有利于放線菌門的生長繁殖，但隨著連作年限的增加，當(dāng)歸連作根際土壤中的放線菌門相對豐度下降.這與連作后土壤養(yǎng)分含量的降低有關(guān)，這一現(xiàn)象在其他植物連作研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)，例如苜蓿土壤中放線菌門相對豐度會(huì)隨著種植年限的增加而下降，且在土壤養(yǎng)分不充足的農(nóng)田土壤中放線菌門相對豐度顯著低于苜蓿土壤，說明土壤養(yǎng)分含量是影響放線菌門相對豐度的主要因素[36].然而，酸桿菌門與放線菌門的相對豐度變化趨勢恰好相反，閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸連作根際土壤中酸桿菌門相對豐度均高于休耕地土壤，且隨著連作年限的增加而增加，這與Fierer等[37]研究結(jié)果一致，說明土壤養(yǎng)分環(huán)境與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)，寡營養(yǎng)的土壤環(huán)境更有利于酸桿菌門的生長繁殖.此外，當(dāng)歸連作根際土壤與休耕地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的不同之處，主要表現(xiàn)為各優(yōu)勢菌門在兩者中相對豐度值不同，F(xiàn)1中放線菌門的相對豐度值最大，F(xiàn)2中變形菌門和厚壁菌門的相對豐度值最大，F(xiàn)3中綠彎菌門和芽單胞菌門的相對豐度值最大，F(xiàn)4中酸桿菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度值最大，CK_J中擬桿菌門的相對豐度值最大，整體上優(yōu)勢菌門的群落結(jié)構(gòu)組成基本穩(wěn)定[38].屬水平下，休耕地土壤中主要優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒桿菌屬、藤黃單胞菌屬和紅球菌屬等，當(dāng)歸連作根際土壤中主要優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、分支桿菌屬、紅游動(dòng)菌屬和Kaistobacter等，休耕地土壤與根際土壤細(xì)菌群落的共有優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬.除此之外，兩者間優(yōu)勢菌屬結(jié)構(gòu)組成變化較大，說明隨著當(dāng)歸連作年限的增加，植物—土壤—微生物生態(tài)系統(tǒng)也會(huì)不斷發(fā)生變化以適應(yīng)外界環(huán)境.已有研究表明，連續(xù)種植或已經(jīng)出現(xiàn)土傳病害(如根腐病)后的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，不再維持原有的群落平衡，且土壤病害程度和種植年限都會(huì)改變土壤細(xì)菌的核心微生物群落，使群落成員不斷向亞健康演替，同時(shí)伴隨新類群的出現(xiàn)[27,39].當(dāng)歸連作根際土壤細(xì)菌群落中，未分類菌屬的相對豐度(65.5%～70.5%)均高于休耕地土壤(64.9%)，表明連作年限的增加可能會(huì)導(dǎo)致土壤中原有的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成被打破，從而出現(xiàn)了新的組成模式.

微生物群落結(jié)構(gòu)對土壤理化性質(zhì)的變化高度敏感，土壤pH以及可利用的養(yǎng)分含量等近端因素都會(huì)直接影響微生物群落結(jié)構(gòu)[40].Zhao等[41]研究連作下施加煙稈炭對白及土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，施加外源物質(zhì)可以顯著改善土壤理化性質(zhì)，同時(shí)引起細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變.姜小鳳等[42]在研究不同混種模式下當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性中發(fā)現(xiàn)，土壤pH、有機(jī)質(zhì)和速效磷與細(xì)菌優(yōu)勢菌門顯著相關(guān)，土壤電導(dǎo)率、速效磷和速效鉀與細(xì)菌優(yōu)勢菌屬顯著相關(guān).閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的RDA分析結(jié)果表明，優(yōu)勢菌門與土壤pH、電導(dǎo)率和全氮含量相關(guān)性較高，優(yōu)勢菌屬與土壤pH、速效磷和全氮含量相關(guān)性較高.土壤pH在土壤理化性質(zhì)中占據(jù)著重要地位，主要影響土壤有效養(yǎng)分含量和微生物多樣性等[43].隨著連作年限的增加，當(dāng)歸連作根際土壤pH不斷升高，可能與長期施加尿素等化學(xué)肥料，土壤消化作用較強(qiáng)導(dǎo)致土壤中硝酸鹽的積累有關(guān)[44].此外，土壤pH又是土壤硝化作用的主要影響因素[45].曹彥強(qiáng)等[46]研究不同pH土壤的消化活性及細(xì)菌群落組成發(fā)現(xiàn)，硝化螺旋菌屬是土壤硝化作用的主要功能菌，且在一定范圍內(nèi)消化活性、功能菌的相對豐度會(huì)隨pH的升高而增加.隨著連作年限的增加，當(dāng)歸連作根際土壤細(xì)菌群落中硝化螺旋菌屬的相對豐度(0.5%～1.1%)隨土壤pH的升高而升高，與上述結(jié)果一致.由此說明土壤理化性質(zhì)也是影響當(dāng)歸連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素之一.

甘肅岷縣閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸種植區(qū)土壤細(xì)菌群落功能預(yù)測主要涉及6個(gè)一級(jí)功能層、47個(gè)二級(jí)功能層和384個(gè)三級(jí)功能層，土壤細(xì)菌相對豐度前20的三級(jí)功能層以代謝為主，其次包括遺傳信息處理和細(xì)胞過程等.土壤細(xì)菌群落的代謝功能在土壤養(yǎng)分循環(huán)等方面起著重要作用[47].例如，土壤中解磷微生物通過溶解和礦化作用高效釋放土壤中的磷[48]；固碳微生物的碳代謝強(qiáng)度會(huì)影響土壤中碳的循環(huán)利用[49].另外，在代謝功能的作用下土壤細(xì)菌群落會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，如抗生素、萜類化合物等，這些化合物對植物連作的影響較大[50-51].隨著連作年限的增加，當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落基因功能預(yù)測的前20個(gè)功能相對豐度變化較大，表明亞健康下的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化會(huì)引起群落功能的改變，可能會(huì)導(dǎo)致土壤環(huán)境不利于植物的生長.

綜上所述，閭井鎮(zhèn)當(dāng)歸連作根際土壤細(xì)菌群落多樣性均高于休耕地土壤，且隨連作年限的增加，根際土壤細(xì)菌多樣性呈先降低后增加的趨勢.門水平下，兩者間的共有優(yōu)勢菌門為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、厚壁菌門和酸桿菌門，其中根際土壤放線菌門的相對豐度均值低于休耕地土壤，且隨連作年限的增加而降低，而酸桿菌門的相對豐度均高于休耕地，并隨著連作年限的增加而增加；屬水平下，兩者間的共有優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬，其余優(yōu)勢菌屬則各不相同.影響當(dāng)歸連作土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢菌門的主要因素為土壤pH、電導(dǎo)率和全氮含量，影響優(yōu)勢菌屬的主要因素為土壤pH、速效磷和全氮含量.細(xì)菌群落功能預(yù)測以代謝作用為主，三級(jí)功能層下當(dāng)歸根際土壤細(xì)菌群落主要基因功能的相對豐度隨連作年限的增加而增高.