孫樂明，王華磊，李金玲，盧文婧，何勝兵，陳芝慧，李益益，羅春麗※

（1.貴州大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州同德藥業(yè)有限公司，貴州 銅仁 554300；4.貴州信邦制藥股份有限公司，貴州 貴陽 550000）

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua.）為百合科黃精屬的多年生草本植物，以干燥根莖入藥；為《中國藥典》2020版（一部）收錄藥用黃精（Polygonati rhizoma）的來源之一，因根莖外形如姜，故又稱“姜形黃精”，俗稱“老虎姜”，食藥兩用，含有多糖、黃酮、皂苷、蒽酮類和氨基酸等多種活性成分[1]，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺和益腎的功效，可用于補脾氣、養(yǎng)脾陰、治療肺之氣陰兩傷、改善肝腎虧虛和經(jīng)血不足等癥[2,3]。多花黃精可有效抑制血壓、血糖和血脂的異常升高，具有延緩衰老、增強免疫力和記憶力、有效抑制病毒活性以及抗腫瘤、抗炎和抗菌等多種藥理作用，如今已廣泛應用于臨床[4-6]。

黃精作為貴州中藥材產(chǎn)業(yè)大力支持和發(fā)展的7個單品之一，在不斷推廣黃精大面積種植的前提下，必須保證其產(chǎn)量與品質(zhì)。本文以貴州六盤水市六枝特區(qū)落別鄉(xiāng)多花黃精種植基地為例，綜合評價不同生長年限及采收時期對黔產(chǎn)多花黃精質(zhì)量的影響，優(yōu)選出多花黃精在此區(qū)域內(nèi)最適宜的生長年限及合理采收期，為進一步擴大區(qū)域研究多花黃精的合理采收年限及采收時期提供參考。

1 實驗材料

1.1 材料來源

樣品來源為貴州省六盤水市六枝特區(qū)落別鄉(xiāng)櫻桃林下人工種植多花黃精地下塊莖。六枝特區(qū)地處云貴高原東斜坡烏蒙山與苗嶺山脈的銜接地帶，基本形態(tài)是西北高東南低，河谷深，地表破碎，地形變化大。區(qū)內(nèi)最高的老王山海拔2 126.9 m，北盤江出境處海拔609.5 m，相對高差達1m517.4m，區(qū)內(nèi)平均海拔在1 200～1 400 m之間，六枝特區(qū)屬亞熱帶季風溫暖濕潤氣候，年均氣溫14.5℃，7月份月平均氣溫22℃，極端最高氣溫34.1℃；1月份平均氣溫5.2℃，極端最低氣溫5.6℃，氣候較為溫和，且常年雨量充足。

采用5點取樣法于2020年10月底至2021年1月初每隔半月采集同一種植地塊、相同生長條件下人工種植多花黃精鮮品；并分別采挖生長年限為1年、2年、3年、4年及5年的多花黃精鮮品。

1.2 實驗儀器

實驗儀器，見表1。

表1 實驗儀器Table 1 Experimental instruments

1.3 試劑與藥品

試劑與藥品，見表2。

表2 試劑與藥品Table 2 Reagents and drugs

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)分析方法

利用Microsoft Office Excel 2016軟件對上述檢測數(shù)據(jù)進行處理，利用DPS9.01數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan新復極差法進行差異顯著性分析，利用隸屬函數(shù)法對黔產(chǎn)多花黃精的各質(zhì)量評價指標進行綜合分析。

2.2 不同生長年限黔產(chǎn)林下多花黃精質(zhì)量差異研究

2.2.1 不同生長年限多花黃精藥材前處理 將采挖的多花黃精完整塊莖清除泥沙，剪去須根，流水沖刷洗凈，控干水分，置于煮沸蒸鍋中蒸制10～20 min至透心，取出，60℃烘至恒重，按不同生長年限分別粉碎，備用。

2.2.2 不同生長年限多花黃精水分及灰分含量測定

2.2.2.1 水分及灰分測定方法 將不同生長年限黃精反復清洗至無泥土及雜質(zhì)；水分照《中國藥典》2020年版（四部）中通則0832水分測定法第二法測定；灰分照《中國藥典》2020年版（四部）中通則2302灰分測定法測定。

2.2.2.2 檢測結(jié)果 水分測定：測定不同生長年限的黔產(chǎn)多花黃精的水分，同等條件下測定，1～5年生黔產(chǎn)多花黃精水分含量均低于18%，符合《中國藥典》2020版（一部）對黃精水分含量的要求。從1年生到5年生，水分含量分別為7.38%、9.34%、10.84%、10.89%和11.11%。黔產(chǎn)多花黃精水分含量在1～5年生呈上升趨勢?；曳譁y定：參照2.2.2.1實驗方法測定不同生長年限的黔產(chǎn)多花黃精灰分含量。生長年限為1～5年的黔產(chǎn)多花黃精灰分含量均低于4%，符合《中國藥典》2020版（一部）對灰分含量的要求。從1年生到5年生，多花黃精灰分含量分別為3.48%、3.19%、2.80%、2.63%和3.03%。黔產(chǎn)多花黃精灰分含量在1～4年生呈下降趨勢，4～5年生時含量出現(xiàn)上升。

2.2.3 不同生長年限多花黃精醇浸出物、多糖及總皂苷含量測定

2.2.3.1 檢測方法及標準曲線繪制 浸出物測定：按照2020版《中華人民共和國藥典》四部（通則2201）醇溶性浸出物測定法，用稀乙醇作溶劑，以干燥品計算。多糖含量測定：取經(jīng)105℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品33 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，每1mL中含無水葡萄糖0.33mg。

精密量取對照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL和0.6 mL，分別置于10 mL具塞刻度試管中，各加水至2.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮 硫酸溶液至刻度處，混勻，放冷后置于水浴中保溫10 min，取出，立即放冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應試劑為空白，提取的待測液及標準溶液用酶標儀在582 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，以吸光度對葡萄糖濃度回歸，得到回歸方程y=22.656x+0.082，r=0.999 7，結(jié)果表明，標準品濃度在0.003 3～0.019 8 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

總皂苷測定參照尤新軍[7]的方法優(yōu)化后測定。標準曲線的制備：取人參皂苷Rb1對照品5 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得1.0 mg/mL人參皂苷Rb1對照品溶液。精密量取對照品溶液0.12 mL、0.24 mL、0.36 mL、0.48 mL、0.60 mL、0.72 mL和0.84 mL分別置于10 mL具塞試管中，進行顯色反應（揮干溶劑，加入5%新鮮香草醛 冰乙酸溶液0.2 mL，在冰水浴中加入高氯酸0.8 mL后搖勻，靜置5 min，60℃水浴加熱15 min后，冰浴2 min，加入5 mL冰醋酸，搖勻，靜置5 min，完成顯色），以對應試劑為空白對照，用酶標儀于543 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

供試品測定：將多花黃精粉末于60℃烘箱中干燥至恒重后過80目篩，取0.1 g，精密稱定，置于250 mL錐形瓶中，加入40 mL 80%甲醇，加塞后放入超聲提取儀中提取90 min，過濾，濾液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，密塞搖勻，即得。用移液槍取0.5 mL待測液于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，按標準曲線繪制項下方法顯色，酶標儀543 nm波長處測定吸光度值。計算黔產(chǎn)林下種植多花黃精供試品溶液中總皂苷含量。

繪制標準曲線，以吸光度對人參皂苷Rb1濃度回歸，得到回歸方程y=8.162 6x+0.007 8，r=0.996 1，結(jié)果表明，標準品溶液濃度在0.12～0.84 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3.2 檢測結(jié)果 黔產(chǎn)多花黃精多糖醇溶性浸出物、多糖及總皂苷含量結(jié)果，見表3。

表3 不同生長年限的黔產(chǎn)多花黃精醇浸出物、多糖及總皂苷含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of the alcohol extract,polysaccharide and total saponins of Polygonatum cyrtonema produced in Guizhou at different growth years

由表3可知，1～5年生多花黃精浸出物含量均高于45%，符合《中國藥典》2020版（一部）中對黃精醇浸出物含量的要求。其中，2年生醇浸出物含量最高，其值為75.14%，顯著高于1年生醇浸出物含量，分別比1、3、4、5年生高3.54%、1.66%、0.98%、1.14%。其次為4年生和5年生，含量分別為74.16%和74.00%。1年生醇浸出物含量最低。生長年限為2、3、4、5年的醇浸出物含量差異不顯著。

由表3可知，生長年限對黔產(chǎn)多花黃精多糖含量積累影響顯著。整體呈先上升后下降的趨勢，在1～2年間多糖含量漲幅最大，2～4年之間較為平穩(wěn)，4～5年多糖含量降低且降幅較大。除1年生多糖含量未達到7%以外，其余年限多糖含量均超過7%，符合《中國藥典》2020版（一部）中對黃精多糖含量的要求。1年生的多糖含量最低，其值為6.96%，極顯著低于3、4年生多糖含量，顯著低于2年生多糖含量，與5年生多糖含量差異不顯著。3年生的多糖含量最高，其值為14.37%，極顯著高于1年生多糖含量，顯著高于5年生多糖含量，多糖含量分別比1、2、4、5年高7.14%、3.17%、1.19%和4.64%，與4年生的差異最小。2、3、4年生多糖含量差異顯著，4年生和5年生多糖含量差異不顯著。

由表3可知，總皂苷含量整體隨著生長年限升高而升高，3～4年生之間有小幅下降，其中最大值為5年生13.70%，最小值為1年生12.46%，但各生長年限之間總皂苷含量差異不顯著。

2.3 黔產(chǎn)林下多花黃精不同采收期質(zhì)量差異研究

2.3.1 不同采收期多花黃精藥材前處理 每次采樣，選擇多花黃精的第1、2、3年齡節(jié)，除雜，洗凈，去除須根，控干水分，蒸至透心，60℃烘至恒重，粉碎，備用。

2.3.2 不同采收時期多花黃精折干率與水分測定 對不同采收時期多花黃精折干率進行測定，折干率=干重/鮮重100%。折干率可以反映出其干物質(zhì)的儲存狀況，在一定程度上反映其產(chǎn)量的多少。水分測定照《中國藥典》2020年版（四部）中通則0832水分測定法第二法測定。

由圖1可知，采收時期的不同，黃精的水分含量存在差異，在11月15日采收的多花黃精水分含量最高，為7.18%。12月15日采收的黃精水分含量最低，為6.62%；12月15日采收的黃精折干率最高，為26.97%，次年1月3日采收的最低，為17.91%。從10月底到11月中旬，其水分含量升高，此時地上部分未完全枯萎，可能因為氣候的原因光合作用短時間內(nèi)增強，相關(guān)性分析表明，折干率與水分呈負相關(guān)，12月15日多花黃精水分含量降低，此時折干率高，到次年1月初，新芽萌發(fā)，代謝能力逐漸增強，水分含量再次升高，折干率降低。

圖1 不同采收時期多花黃精水分與折干率比較Fig.1 Comparison of water content and drying rate of Polygonatum cyrtonema at different harvest periods

2.3.3 不同采收時期多花黃精浸出物、總皂苷和多糖含量比較 按2.2.3.1項下方法，測定不同采收時期多花黃精浸出物、總皂苷和多糖含量。黃精浸出物與多糖含量均是降低 升高 降低趨勢，總皂苷與折干率的變化波動較明顯，同時呈現(xiàn)升高 降低 升高 降低的趨勢。整體來說，浸出物、多糖、總皂苷以及折干率的變化的共同點是從12月15到次年1月3日其含量均降低。

由表4可知，浸出物與多糖、總皂苷及折干率呈正相關(guān)，與水分沒有相關(guān)性，與灰分呈顯著負相關(guān)；多糖與灰分呈負相關(guān)，與總皂苷、水分及折干率呈正相關(guān)；灰分與總皂苷呈正相關(guān)，與水分和折干率呈負相關(guān)；總皂苷與水分呈負相關(guān)，與折干率呈正相關(guān)；水分與折干率呈負相關(guān)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)灰分與浸出物、水分、多糖及折干率等指標均呈負相關(guān)，表明灰分會影響多花黃精藥用成分的積累。

表4 不同采收時期多花黃精的多糖、浸出物與總皂苷含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of the polysaccharide,extract and total saponins of Polygonatum cyrtonema at different harvest periods

3 分析與討論

3.1 結(jié)果分析

3.1.1 不同生長年限黔產(chǎn)林下多花黃精各項指標成分含量綜合分析 單個指標的差異無法較為準確的評價不同生長年限的黔產(chǎn)林下多花黃精質(zhì)量優(yōu)劣，因此選用隸屬函數(shù)法對黔產(chǎn)多花黃精的各質(zhì)量評價指標進行綜合分析，分別以多糖、總皂苷和醇溶性浸出物等每項測定指標的不同年限測定值與最小值之差為分子，以最大值與最小值之差為分母，比值為隸屬函數(shù)值，優(yōu)選出黔產(chǎn)多花黃精適宜的生長年限。結(jié)果見表5。

表5 隸屬函數(shù)值及綜合排名Table 5 Membership function value and comprehensive ranking

由表5可知，各指標隸屬函數(shù)值均在[0-1]之間，符合隸屬函數(shù)法平均隸屬函數(shù)值的范圍。各指標之間總皂苷含量隸屬函數(shù)平均值最高，為0.705，其次是醇浸出物及多糖，分別為0.586和0.557，排名由高到低順序為總皂苷＞醇浸出物＞多糖＞總灰分。在不同生長年限之間隸屬函數(shù)平均值最高為4年生，為0.852，其次為3年生和2年生，為0.811和0.670，排名由高到低為4年生＞3年生＞2年生＞5年生＞1年生，結(jié)果表明，4年生的質(zhì)量相對較好。

3.1.2 不同采收期黔產(chǎn)林下多花黃精各項指標成分含量綜合分析 不同采收期黔產(chǎn)林下多花黃精浸出物、多糖、總皂苷以及折干率的變化的共同點是從12月15日到次年1月3日其含量均降低。

由表6可知，黃精浸出物與多糖含量均是先降低到12月15日升高后又降低，而總皂苷與折干率的變化波動較明顯，但同時呈現(xiàn)增高、降低、增高及降低的趨勢。整體來說，浸出物、多糖、總皂苷以及折干率的變化的共同點是從12月15日到次年1月3日其含量全部降低。故初步認為1月初不適合進行多花黃精的采收。綜合多花黃精各指標來看，12月15日采收的多花黃精品質(zhì)最好，其次分別是11月15日、10月28日、12月1日、次年1月3日?？梢钥闯?，次年1月3日所測的指標整體明顯低于其他采收期，為保證多花黃精產(chǎn)量和質(zhì)量，故該地區(qū)多花黃精建議在12月中旬采收。

表6 不同采收時期隸屬函數(shù)分析Table 6 Membership function analysis of different harvest periods

黔產(chǎn)多花黃精采收期對比研究結(jié)果為10月28日采收的黃精多糖含量最高，為16.56%，隨后逐漸降低，到12月15日升高后降低；有研究表明黃精多糖含量在10月底地上部分完全枯萎時最高，隨后因地下部分新芽萌動導致多糖含量迅速下降[14]。本研究表明，多花黃精在10月底多糖含量達到最高，但是后期降低后又再次升高，12月中旬后降低，可見其地域不同，在相同時期黃精含量的變化也不相同。10月28日采收的灰分含量最低，為2.62%，10月28日采收的浸出物含量最高，為85.75%；11月15日總皂苷含量最高，為14.77%；12月15日采收的折干率最高，為26.97%，此時干物質(zhì)儲存最高。通過相關(guān)性分析，灰分與黃精多個指標均呈負相關(guān)，研究表明，灰分含量的高低會影響藥用成分的形成。

3.2 討論

周新華等[8]曾通過實驗研究了多花黃精在不同生長年限和林下生境2個因素影響下其成分的差異情況，結(jié)果表明對多花黃精藥用活性成分含量影響最大的因素是生長年限，在其實驗所測出的指標結(jié)果變化趨勢中，多糖含量先隨著多花黃精的生長年限逐漸升高，在生長年限為6年時有下降，與本實驗中多糖含量在3年之前逐漸升高，3年至5年逐漸下降的趨勢相似。趙致等[9]在對貴州省鳳岡西山黃精GAP試驗示范基地黃精的研究中，得出該地區(qū)黃精在生長年限為4年時最適宜采收的結(jié)論，谷甫剛[10]在對中藥材黃精種植技術(shù)研究的結(jié)果表明，種子繁殖的黃精收獲最佳為4年，與本實驗中的結(jié)論最佳采收年限4年相符，不同生長年限對多花黃精質(zhì)量的影響在不同地區(qū)上的差異還有待進一步研究。

黃俊學等[11]運用響應面法優(yōu)化不同年份黃精中總糖含量的測定，結(jié)果為4年生黃精多糖含量相對較高，黨康[12]對略陽縣野生黃精產(chǎn)量測定和多糖分析研究表明3年生根莖多糖含量最高，與本實驗的結(jié)果相似。姜武等[13]在浙產(chǎn)多花黃精最適采收期研究中結(jié)果為浙江地區(qū)根莖繁殖的多花黃精在生長年限為3年時最適合采收，與本實驗結(jié)論相近。

本實驗中多糖在生長年限為3年達到最大值后，4、5年生多糖含量出現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于黔產(chǎn)多花黃精年限越長木質(zhì)化越嚴重，有效成分流失?；曳趾?～4年呈下降趨勢，5年生的灰分卻有小幅上升，通過查閱文獻，這可能是地上部分的莖葉逐漸老化、其光合作用能力下降的原因。

4 結(jié)論

綜合分析黔產(chǎn)林下多花黃精多糖、總皂苷、醇浸出物和灰分的含量，其結(jié)果顯示生長年限為4年時黔產(chǎn)多花黃精質(zhì)量最好，生長年限為2、3年的黔產(chǎn)多花黃精質(zhì)量較好，因此，優(yōu)選林下多花黃精在此區(qū)域適宜的生長年限以4年生為佳。在此基礎上，研究表明該區(qū)域的多花黃精在10月底到次年1月初均可采收，綜合考慮各有效成分在12月15日前后采收為佳，若只考慮其浸出物與多糖含量，建議在10月底采收最佳，若以總皂苷作為藥用成分，則以11月15日到12月15日內(nèi)采收為佳。

多花黃精林下種植，可將農(nóng)業(yè)、林業(yè)和旅游業(yè)進行有機組合，為現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興提供一個新方向；明確林下種植多花黃精合理采收年限為4年、采收時期以12月中下旬為宜，為保證穩(wěn)定的產(chǎn)量及質(zhì)量提供借鑒；可持續(xù)發(fā)揮對周邊地區(qū)的輻射作用，可促進農(nóng)業(yè)增效與鄉(xiāng)村振興建設、維護生物多樣性、保護生態(tài)環(huán)境等方面具有積極的意義。