何若男，劉思師，吳婷，曾穎，陳建福，陳雅欣，陳仲巍

（1.廈門醫(yī)學院，天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學院，藥學系，福建 廈門 361023；3.漳州職業(yè)技術(shù)學院食品工程學院，福建 漳州 363000）

枸杞葉別稱地仙苗、天精草，自古便為我國藥食兩用植物，營養(yǎng)價值居于食物前列。枸杞葉富含有多糖類[1]、甾體類及包括黃酮類[2]在內(nèi)的各種酚酸類[3]、氨基酸與精胺類、褪黑素、甜菜堿和類胡蘿卜素等類型豐富的營養(yǎng)物質(zhì)及資源性化學成分[4-6]。已有研究證實，枸杞葉在抑菌、神經(jīng)保護[7]、抗氧化、調(diào)血脂[8]、降血糖[9]、抗腫瘤和增強機體免疫等方面展現(xiàn)生物學活性。OLATUNJI[10]發(fā)現(xiàn)枸杞葉乙酸乙酯提取物可通過調(diào)節(jié)氧化應激來實現(xiàn)降血糖和降血脂，其中，酚酸類作為活性功能成分能夠提升胰島素敏感性，同時抑制著由高血糖所介導的腎臟氧化應激以及炎癥反應，以此緩和糖尿病致使的腎損傷[8]，并起到糖尿病的預防和治療作用。此外，枸杞葉含有的多酚類成分也展現(xiàn)出了顯著的抗氧化活性[11]，LEE S R等[12]以高糖誘導炎癥并患有高脂的小鼠為樣本，對其飼喂摻雜枸杞葉的飼料后發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道上皮細胞間的緊密連接完整性得以增加，一氧化氮的產(chǎn)生減少，同時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應激和炎癥反應得到抑制，凸顯了其抗氧化與抗炎功效。已有研究證實，枸杞葉中黃酮類成分的含量可超出枸杞果實近10倍[13]，黑果枸杞芽茶的總多酚、總黃酮和氨基酸含量顯著高于紅果枸杞葉茶[14]，故而，黑枸杞葉成為了當前的一種食品新資源。時至今日，枸杞資源相關(guān)產(chǎn)業(yè)在國家戰(zhàn)略和群眾的支持下發(fā)展迅猛[15]，種植面積逐年擴增，已逐步成為我國西北部特色支柱產(chǎn)業(yè)之一。而枸杞葉作為枸杞果藥材的副產(chǎn)物，除少部分作為枸杞芽茶市售，每年都有近百萬噸被廢棄，造成資源浪費。因此，對枸杞葉的資源價值進行開發(fā)和工業(yè)化研究，在符合我國鄉(xiāng)村振興的同時，具有良好市場和可持續(xù)發(fā)展前景。

微波輔助萃取作為近年發(fā)展、推廣的一種新型技術(shù)得到廣泛研究。微波以其非電離的電磁輻射作用力對樣品的氫鍵以及分子間作用力造成破壞，同時可使樣品的溶質(zhì)溶液內(nèi)外均勻受熱，助力于短時內(nèi)高效溶浸出樣品細胞的胞內(nèi)容物。超聲波作為廣泛長期使用的一種傳統(tǒng)提取方法，其用于諸如多酚類物質(zhì)的萃取時，主要由其強大的空化作用和振動效應對樣品產(chǎn)生沖擊波作用力及猛烈的機械效應，迅速破壞細胞壁溶出胞內(nèi)物質(zhì)，以此提高傳質(zhì)速率[16]。二者結(jié)合，相輔相成下優(yōu)勢結(jié)合可將提取效率大幅提升，同時摒棄了傳統(tǒng)熱水浸提法耗時久、易糊化的缺點，與酶提取法相比成本也大幅降低，具有低化學試劑用量、操作簡便、短時高效和成本低廉等優(yōu)勢。此外，該法尤其在性質(zhì)不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物提取中展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[17]。本研究采取微波 超聲波協(xié)同提取試驗方式，探索各因素對黑枸杞葉總多酚萃得率的影響，并以響應面法探索確定最佳條件，為黑枸杞葉的資源開發(fā)再利用研究提供參考和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

紅枸杞葉、黑枸杞葉分別采摘自福建漳州南靖6.5年生的枸杞成樹，選取無蟲害、無機械損傷的新鮮葉片（由廈門醫(yī)學院中藥學實驗師張娜鑒定）；沒食子酸、Tris、福林酚、L（+）-抗壞血酸（分析純）A8100（北京索萊寶科技有限公司）；DPPH自由基[分析純，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；鄰苯三酚、無水碳酸鈉、水楊酸、氫氧化鈉、無水乙醇、硫酸亞鐵（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。粉碎機（廣州市旭朗機械設備有限公司XL-10B）；電子分析天平（sartorius BSA2202S-CW）；微波超聲波萃取儀（Xinyi-2A升級款）；臺式高速離心機[Sigma離心機（揚州）有限公司3K15]；酶標儀（BioTek EPOCH/2）；超低溫保存箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司DW-25L262）；pH計（EUTECH pH700）。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑枸杞葉粉的制備 挑選無腐爛、無蟲害的新鮮黑枸杞葉，清洗晾干后置于65℃電熱鼓風干燥箱干燥至恒重，放入萬能粉碎機粉碎并過80目（180um）篩，所得干物質(zhì)放置于干燥器內(nèi)避光密閉保存。

1.2.2 黑枸杞葉多酚類物質(zhì)提取方法 稱取經(jīng)預處理的黑枸杞葉粉末（1.00±0.05）g共3份分別放置于3個微波 超聲50 mL容器內(nèi)，混合以相應料液比的提取溶劑，采用超聲波 微波協(xié)同反應系統(tǒng)（恒定70℃）萃取一定時間，后經(jīng)5 000 r/min旋轉(zhuǎn)離心5min分離留取上清液，以福林 酚比色法測定黑枸杞葉多酚類物質(zhì)含量。

1.2.3 總酚標準曲線的繪制及黑枸杞葉總酚含量測定 參考劉皓涵等[18]的方法，采取福林 酚比色法，略加改動。以0.2 mL為固定間隔等梯度取樣新鮮預配置的標準工作試液（100 mg/L的沒食子酸標準品溶液）0～1.4 mL，反應后測定吸光度值，并以此繪制該標準曲線。同等條件下以相同方法，精確吸取適量的黑枸杞葉萃取樣品液，測定并記錄其對應吸光度后代入以下標準公式計算得黑枸杞葉萃取樣品溶液得總酚物質(zhì)含量m。

上式中A為所測黑枸杞葉樣液吸光度值；0.003 8為空白吸光度值；d為樣液稀釋倍數(shù)；v為樣液體積，mL；0.064 8為沒食子酸標準曲線的斜率。

1.2.4 黑枸杞葉總酚超聲波-微波協(xié)同萃取單因素實驗 以黑枸杞葉多酚提取率為因變量，分別以料液比、微波功率、萃取時間、超聲功率和乙醇體積分數(shù)為考察因素，參考1.2.2的提取方法，獨立探究各單因素對黑枸杞葉多酚提取率的影響。

1.2.4.1 料液比對黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、乙醇體積濃度60%、超聲功率和微波功率均200 W、萃取時間10 min條件下，設置5個液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平（10、15、20、25和30），平行提取3次，考察對黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.4.2 微波功率對黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、乙醇體積濃度60%、超聲功率200W、液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平25:1，萃取時間10 min條件下，設置5個微波功率（W）水平（100、200、300、400和500），平行提取3次，考察對黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.4.4 萃取時間對黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、乙醇體積濃度60%、超聲功率及微波功率均200 W、液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平25:1條件下，設置5個提取時間（min）水平（6、8、10、12和14）平行提取3次，考察對黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.4.3 乙醇體積分數(shù)對黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、超聲功率及微波功率均200 W、液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平25:1、萃取時間10 min條件下，設置5個乙醇體積分數(shù)（%）水平（40、50、60、70和80）平行提取3次，考察對黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.4.5 超聲功率對黑枸杞葉多酚提取量的影響 以固定溫度70℃[19]、乙醇體積濃度60%、微波功率200W、液料比（乙醇/黑枸杞葉粉，mL/g）水平25:1，萃取時間10 min條件下，設置5個超聲功率（W）水平（100、200、300、400和500），平行提取3次，考察對黑枸杞葉多酚提取量的影響。

1.2.5 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上，選取對黑枸杞葉總多酚提取有顯著影響的時間、微波功率及超聲功率3個因素，以黑枸杞葉總酚提得率為響應值來進行中心組合試驗設計，該試驗水平編碼及試驗因素見表1。

表1 響應面設計因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 黑枸杞葉體外抗氧化能力的測定 稱取等量的黑枸杞葉和紅枸杞葉，以同樣的方式分別進行總酚提取，隨后在適當?shù)奶荻认♂尯蟮玫酱郎y黑枸杞葉和紅枸杞葉樣品。

1.2.6.1 黑枸杞葉提取液對DPPH自由基的清除能力 參照SONG等[20]的方案略作修繕，將精準配制的一系列梯度濃度黑枸杞葉、紅枸杞葉的新鮮樣液分別裝入試管，取等體積當日新鮮配置的DPPH溶液（0.2 mM）于暗處避光混合均勻，即刻測定其在517 nm波長處的吸光值標記為A1，25℃于暗處避光恒溫反應40 min隨后測定標記為A0，對照組替換紅枸杞葉樣液、黑枸杞葉樣液為去離子水測定得A2。以K1（%）表示其DPPH清除率。

1.2.6.2 黑枸杞葉提取液對羥自由基的清除能力 參考劉皓涵等[18]的方案略作修改，精準移取新鮮配制的一系列濃度黑枸杞葉和紅枸杞葉提取樣液分別與等體積1.76 mM的FeSO4（當日新鮮配置）、等體積1.76 mM的水楊酸-乙醇（其以50%乙醇為溶劑）均勻混合，隨后加入等體積1.76 mM的H2O2（加入即刻啟動反應），37℃避光恒溫反應至30 min后，即刻測定其于510 nm波長處的吸光值并標記為A'1。以紅枸杞葉/黑枸杞葉樣液與3倍體積無水乙醇均勻混合測定吸光值標記為A'0，以蒸餾水替代紅枸杞葉/黑枸杞葉樣液為空白對照標記為A'2。以K2（%）表示其羥自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑枸杞葉總多酚提取單因素試驗

2.1.1 微波功率對黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖1可知，隨著微波功率逐步增加，黑枸杞葉總多酚的萃得率顯示出早期增加后期降低的態(tài)勢，此因微波作用影響破壞了一部分氫鍵以及分子間作用力，破壞了黑枸杞葉細胞，而隨著該作用力進一步增強，會促使部分植物多酚物質(zhì)被同步損壞[21]、提取溶劑進一步揮發(fā)，且提取溫度變得更難以控制，需要更多的間歇時長以保持溫度恒定，進而致使萃得量下降。微波功率達到200 W時，提得量最高達4.39 mg/g，因故，最適微波功率選取200 W為宜。

圖1 微波功率對黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.1 Effects of microwave power on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.2 液料比對黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖2可得知，隨著液料比的增加，黑枸杞葉總多酚得率先增加后降低，這是由于初期黑枸杞葉細胞中多酚物質(zhì)與提取溶劑乙醇的濃度差與接觸面積逐步增大，且溶劑分子愈多，則超聲波作用下的傳質(zhì)動力也愈大，進而助力多酚類物質(zhì)的溶解及浸出[22]，后期則有更多的雜質(zhì)被溶出影響了目標物的提取，且過分劇烈的空化效應及超聲作用力也將黑枸杞葉胞內(nèi)多酚物質(zhì)破壞。當液料比為20:1（mL/g）時，其萃得量最高可達4.72 mg/g。當液料比超出20:1（mL/g）時，或因其余溶解物的競爭性抑制致使萃得率減少。故而，黑枸杞葉多酚萃取的最適液料比選取20:1（mL/g）為宜。

圖2 液料比對黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratio on the extraction amount of black wolfberry leaf

2.1.3 提取時間對黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖3可看出，隨著萃取時間的延長，黑枸杞葉總多酚的得率呈現(xiàn)6～12 min增加，隨后再降低的態(tài)勢。初期隨著協(xié)同萃取時長的增加，更多的細胞被破壞使得目標黑枸杞葉多酚物質(zhì)溶出，而隨著時間的進一步增加，目的萃取物也被破壞。協(xié)同萃取時間達到12 min時，萃得量最高達4.16 mg/g。

圖3 時間對黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖4可看出隨著提取溶劑乙醇所占體積分數(shù)的增加，黑枸杞葉總多酚得率先增加后降低，前期的增加是由于溶質(zhì)分子的存在有助于其余溶質(zhì)分子的溶出，進而助力于黑枸杞葉多酚類物質(zhì)的浸出[23]，乙醇體積分數(shù)為50%時，其提取量最高達4.34 mg/g。

圖4乙醇體積分數(shù)對黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.5 超聲功率對黑枸杞葉總多酚提取量的影響 由圖5可看出，隨著超聲功率的提高，黑枸杞葉總多酚的萃得率在100～400 W持續(xù)增加，或因超聲波的強大機械與空化作用力破壞了黑枸杞葉的細胞壁及細胞膜、細胞間質(zhì)，促使其胞內(nèi)物質(zhì)迅速溶解釋放。當功率超出400 W后，過分大的作用力又促使著其酚類物質(zhì)更多地發(fā)生了包括聚合、氧化在內(nèi)的化學反應[24]，與此同時對黑枸杞葉中諸如鄰二酚羥基等[25]多酚類物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)造成損壞，降低了萃取率。因而，選取超聲功率400 W為該提取液的最宜條件，試驗表明其最高提取量達5.622 mg/g。

圖5 超聲波功率對黑枸杞葉多酚提取量的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.2 響應面優(yōu)化黑枸杞葉多酚提取試驗

2.2.1 響應面實驗 結(jié)合單因素實際結(jié)果，將影響較小的乙醇體積分數(shù)設置為50%不變，液料比設置為20:1（mL/g）不變，同時固定萃取溫度為70℃，選用超聲功率、微波功率、時間為自變量，以黑枸杞葉總多酚萃得量（率）為響應值進行優(yōu)化。具體試驗方案及結(jié)果分析見表2。本試驗采用Design-Expert 12.0軟件對表2所示結(jié)果值進行響應面回歸分析，獲得黑枸杞葉總多酚萃得率為響應值的二次多項回歸模型為：Y=5.83 0.067 4A 0.199 4B 0.311 0C+0.204 6AB+0.209 3AC 0.282 4BC 0.611 3A20.396 2B20.684 5C2，由二次項系數(shù)皆為負數(shù)可知，拋物線開口朝下，擁有極大值點。表3所示的方差分析結(jié)果表明：模型回歸為極顯著（P＜0.000 1），失擬項為不顯著（P＞0.05），預示外界其余因素對該試驗結(jié)果干擾并不顯著。模型的決定系數(shù)為R2=0.983 4，表明實際測試所得數(shù)據(jù)與回歸方程之間展現(xiàn)良好吻合關(guān)系，能夠較好反映出黑枸杞葉多酚萃得量與超聲功率、微波功率與萃取時間的關(guān)系。同時可知，各因素對萃得率的影響大小為：C＞B＞A，且一次項B和C、交互項BC、二次項A2、B2及C2對萃得率有極顯著影響（即P＜0.01）；交互項AB、AC對萃得率有顯著影響（即P＜0.05）。

表2 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果Table 2 experimental design and results of Box-Behnken

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

2.2.2 響應面圖分析 根據(jù)2.2.1中回歸方程二次模型所制作的黑枸杞葉總酚提取模型響應面立體分析圖和等高線圖見圖6和圖7。圖6和圖7分別反映了3個因素（超聲功率、微波功率和萃取時間）兩兩交互作用情況下對響應值的影響，若等高線坡度較為平緩、狀似圓形表明該兩種因素之間交互作用較不顯著[21,24,25]，若坡度陡峭、排列緊密且狀似橢圓形則表示二因素之間的交互作用相對明顯[19,22]。由圖6、圖7可得，時間和萃取微波功率、超聲功率為0水平時，隨著各水平因素的變化黑枸杞葉多酚提取量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。由等高線圖可知，超聲功率與萃取時間的響應面相對更為陡峭，同時等高線狀似橢圓，說明二者間的交互作用強烈[20]，于黑枸杞葉總萃得率的影響極顯著；微波功率與萃取時間、微波功率與超聲功率的響應面相對平緩，等高線形狀更近圓形，說明交互作用相對較小，但仍交互作用顯著。此結(jié)論與表3所示方差分析P值等結(jié)果一致。

圖6 時間與微波功率對黑枸杞葉多酚提得量的交互影響Fig.6 Interaction effects of time and microwave power on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

圖7 時間與超聲功率對黑枸杞葉多酚提得量的交互影響Fig.7 Interaction effects of ultrasonic power and extraction time on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

圖8 微波功率與超聲功率對黑枸杞葉多酚提得量的交互影響Fig.8 Interaction effects of microwave power and ultrasonic power on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

2.2.3 驗證試驗 對優(yōu)化后的黑枸杞葉多酚提取方程求解，得出試驗分為內(nèi)最佳條件：微波功率187.498 W、萃取時間為11.596 min、超聲功率378.76 W；實際試驗條件下最佳提取工藝為：微波功率190 W、萃取時間為11.6 min、超聲功率380 W。重復3次試驗，黑枸杞葉多酚平均提取量為6.02 mg/g，與預測值基本擬合，表明該優(yōu)化模型可靠。

2.3 黑枸杞葉/紅枸杞葉提取物體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 如圖9所示，黑枸杞葉和紅枸杞葉兩種枸杞樣品葉均具備DPPH自由基清除能力，且該清除力的強弱與兩樣品提取液濃度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性，表明二者均具有抗氧化活性。其中黑枸杞葉樣品的上升幅度更為明顯，在同樣濃度時，黑枸杞葉提取液的體外DPPH自由基清除能力均高于紅枸杞葉。

圖9 紅枸杞葉與黑枸杞葉總多酚提取物對DPPH自由基清除能力對比Fig.9 The scavenging ability of red wolfberry leaf extract and black wolfberry leaf extract on DPPH free radical

2.3.2 羥基自由基清除能力 如圖10，羥自由基清除能力也隨著黑枸杞葉和紅枸杞葉樣品濃度的增加而明顯提升。在總酚質(zhì)量濃度均為80ug/mL附近時，紅枸杞葉、黑枸杞葉的總酚提取物體外對OH的清除能力分別為70%和78%，清除力百分比增長明顯放緩，這或許與硒元素的量增加放緩有關(guān)[24-26]。

圖10 紅枸杞葉與黑枸杞葉總酚提取物對羥自由基的清除能力比較Fig.10 The scavenging ability of red wolfberry leaf extract and black wolfberry leaf extract on hydroxy free radical

3 結(jié)論

3.1 本研究采取微波 超聲波協(xié)同萃取法，以乙醇為提取溶劑探索超聲功率、微波功率、時間、乙醇體積分數(shù)和料液比5個因素作為自變量時對黑枸杞葉多酚提取率的影響，隨后采取響應面法優(yōu)化黑枸杞葉中多酚提取率，獲知最佳工藝參數(shù)為：在溫度為70℃、乙醇體積分數(shù)50%、液料比20:1（mL/g）時，微波功率190 W、萃取時間為11.6 min、超聲功率380 W條件下多酚提取率為6.02 mg/g，與預測值接近，表明該模型能夠用于黑枸杞葉多酚提取工藝優(yōu)化。

3.2 通過對黑枸杞葉和紅枸杞葉中總酚提取物的體外抗氧化能力測定表明，黑枸杞葉的羥自由基清除率及DPPH自由基清除率均全面優(yōu)于紅枸杞葉，可為黑枸杞葉的開發(fā)再利用提供理論支持。