亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        膜過(guò)濾泡菜汁生物膜污染的初步分析

        2022-08-05 09:46:16王玉梅李洋羅佳沂栗曉靜李文毛瑞豐
        中國(guó)調(diào)味品 2022年8期
        關(guān)鍵詞:污染

        王玉梅,李洋,羅佳沂,栗曉靜,李文,毛瑞豐*

        (1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院,南寧 530004;2.廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530006)

        泡菜是自然接種混合發(fā)酵的果蔬發(fā)酵制品[1]。泡菜汁中含有多種微生物[2]且化學(xué)成分復(fù)雜[3],經(jīng)過(guò)處理后可以作為泡菜型產(chǎn)品的風(fēng)味劑、泡菜汁飲品、泡菜風(fēng)味產(chǎn)品原料。泡菜汁的開(kāi)發(fā)利用是解決泡菜生產(chǎn)產(chǎn)生的廢水污染問(wèn)題的重要途徑。

        隨著膜技術(shù)的發(fā)展,膜過(guò)濾因具有低能耗、方便、效率高、無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)在食品行業(yè)應(yīng)用越來(lái)越廣泛[4]。但在膜過(guò)濾使用過(guò)程中,膜污染仍然是一個(gè)很難避免的問(wèn)題。膜污染又分為生物污染、有機(jī)物污染、無(wú)機(jī)物污染及物料原有物質(zhì)(膠體污染)4種類(lèi)型[5]。其中,有機(jī)物污染、無(wú)機(jī)物污染及物料原有物質(zhì)(膠體污染)能通過(guò)一定的手段處理[6-7],但生物污染不僅會(huì)加速膜不可逆污染,且微生物會(huì)附著在膜表面,隨著膜設(shè)備的運(yùn)行,微生物的胞外聚合物(EPS)[8]、微生物活/死菌體[9]、膠體物質(zhì)等會(huì)形成生物膜,增加能耗,降低膜通量,縮短膜的使用壽命。因此,在膜過(guò)濾泡菜汁的過(guò)程中,微生物對(duì)膜的污染問(wèn)題不容小覷,當(dāng)堆積到一定厚度時(shí),甚至?xí)?dǎo)致陶瓷膜報(bào)廢。

        膜過(guò)濾泡菜汁15 h內(nèi),通過(guò)測(cè)定膜通量、微生物的截留率、污染膜上微生物的分離鑒定、污染膜形貌的觀察、EPS含量的變化、污染膜官能團(tuán)分析等分析了膜生物污染的情況,為后續(xù)膜過(guò)濾泡菜汁中膜生物污染控制及清洗提供了理論基礎(chǔ)。

        1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)原料

        泡菜汁:由廣西某泡菜廠提供。取得的泡菜汁經(jīng)8層滅菌紗布過(guò)濾之后即可作為膜處理的原料液。

        1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

        陶瓷膜中試設(shè)備。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 膜通量的測(cè)定

        選用0.05 μm孔徑陶瓷膜管過(guò)濾泡菜汁,在TMP=0.35 MPa, TEM=35 ℃, CFV=4~5 m/s的條件下, 測(cè)定膜過(guò)濾泡菜汁15 h內(nèi)膜通量變化情況。膜通量的計(jì)算公式:

        式中:J為膜滲透通量(L/(m2·h));V為滲透液體積(L);A為膜過(guò)濾面積;t為滲透液所需的時(shí)間(h)。

        1.3.2 泡菜汁菌落總數(shù)的測(cè)定

        測(cè)定不同時(shí)間(1,3,6,9,12,15 h)內(nèi),經(jīng)陶瓷膜過(guò)濾后泡菜汁微生物菌落總數(shù)的變化情況。泡菜汁中細(xì)菌的菌落總數(shù)參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。泡菜汁中真菌的菌落總數(shù)參照GB 4789.15-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》進(jìn)行測(cè)定。

        1.3.3 陶瓷膜管污染微生物的分離鑒定

        1.3.3.1 細(xì)菌和真菌的分離純化

        測(cè)定不同時(shí)間(1,3,6,9,12,15 h)內(nèi),膜過(guò)濾后泡菜汁引起膜管污染微生物的分離鑒定。取3 mL經(jīng)膜過(guò)濾泡菜汁及原泡菜汁樣品于無(wú)菌平板中,用平板傾注法分別倒NA、PDA平板。待平板凝固后,NA平板倒置放在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,PDA平板倒置放在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h,然后對(duì)平板內(nèi)的細(xì)菌和真菌菌株進(jìn)行分離純化,分離純化方法采用平板劃線(xiàn)法,直到獲得純化的單菌落保存于-20 ℃冰箱中。

        1.3.3.2 DNA的提取及PCR擴(kuò)增

        將分離的細(xì)菌于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h,參考細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取,將分離的真菌于PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h,參考真菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系:

        細(xì)菌擴(kuò)增引物:27F/1492R 27F:5′-AGAGTTTGA

        TCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-TACGGCTACCTTG

        TTACGACTT-3′。

        真菌擴(kuò)增引物:ITS1/ITS4 ITS1:5′-TCCGTAGGT

        GAACCTGCGG-3′;ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGAT

        ATGC-3′。

        PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)表1,PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表2。

        表1 PCR擴(kuò)增程序Table 1 PCR amplification procedure

        表2 PCR反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction conditions

        1.3.3.3 DNA與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的保存方法

        DNA與PCR產(chǎn)物分別放置在滅菌的1.5 mL的離心管和PCR管中密封,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.3.4 DNA測(cè)序及序列相似性對(duì)比

        對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,獲得清晰明亮的條帶, PCR產(chǎn)物測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

        16S rRNA和ITS序列分析:序列分析登錄NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),應(yīng)用BLAST程序分別對(duì)所測(cè)得的16S rRNA和ITS序列與GenBank中的核酸進(jìn)行相似性比對(duì)。利用MEGA 7.0軟件[10]計(jì)算序列的堿基組成(compute nucleotide composition)[11],計(jì)算遺傳距離[12],構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[13],檢驗(yàn)各分支的置信度[14]。遺傳距離基于Kimura 2-parameter模式計(jì)算,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基于Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建,各分支的置信度利用自展法(Bootstrap重復(fù)1000次)檢驗(yàn)。

        1.3.4 污染膜顯微結(jié)構(gòu)

        將污染膜管脆斷并獲取其橫斷面和表面的樣品,參考王賀[15]的方法,并稍作修改。

        藍(lán)寶石英文名稱(chēng)為Sapphire,源于拉丁文Spphins,意思是藍(lán)色。象征著穩(wěn)健、端莊和聰慧。自古以來(lái),人們迷醉于藍(lán)寶石內(nèi)所蘊(yùn)含的安靜和強(qiáng)烈的力量。據(jù)說(shuō),藍(lán)寶石是距離神靈最近的寶石,它湛藍(lán)的顏色在任何時(shí)候都不會(huì)改變,甚至影響到藍(lán)色天空的形成。

        1.3.5 泡菜汁中胞外聚合物分布及組成測(cè)定

        泡菜汁中胞外聚合物分布及組成的測(cè)定參考王賀的方法并稍作修改。蛋白含量以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)樣,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[16]。多糖含量以葡萄糖為標(biāo)樣,采用蒽酮硫酸法測(cè)定[17]。

        1.3.6 污染的膜傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜分析

        將已被污染的陶瓷膜脆斷并研磨成粉末,冷凍干燥后,再與烘干至恒重的溴化鉀按一定的比例充分混合研磨均勻,真空壓片后采用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(FTIR),掃描范圍為400~4000 cm-1,掃描次數(shù)64次,對(duì)污染膜官能團(tuán)進(jìn)行分析。

        1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

        原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel及SPSS 26軟件,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2019b軟件進(jìn)行繪制。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 膜過(guò)濾泡菜汁不同過(guò)濾時(shí)間的膜通量分析

        膜設(shè)備本身和膜過(guò)濾泡菜汁工藝成本是影響陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁工藝中的一項(xiàng)重要指標(biāo),膜過(guò)濾泡菜汁15 h內(nèi),膜通量隨時(shí)間的變化結(jié)果見(jiàn)圖1。

        圖1 膜過(guò)濾泡菜汁膜通量隨時(shí)間的變化Fig.1 The changes of membrane flux of pickle juice by membrane filtration with time

        由圖1可知,隨著膜過(guò)濾泡菜汁時(shí)間的延長(zhǎng),膜通量下降,且膜通量從開(kāi)始過(guò)濾到過(guò)濾300 min的階段下降速度較快,而在300~900 min之間膜通量的下降速度較300 min之前慢。究其原因可能是在過(guò)濾初期,泡菜汁含有分子粒徑大小與平均孔徑為0.05 μm的陶瓷膜相似的物質(zhì),在高跨膜壓差的驅(qū)動(dòng)下,進(jìn)入到膜孔內(nèi)進(jìn)而阻塞膜孔或堆積到膜表面的“溝壑”處,且粒徑大小與膜孔徑相似的雜質(zhì)含量越多,最終導(dǎo)致膜通量下降速度越快。膜污染到一定程度后,隨著過(guò)濾時(shí)間的延長(zhǎng),膜通量下降較緩慢,原因可能是即使在較高的跨膜壓差條件下,膜面的濃差極化程度也相差較小。

        2.2 膜過(guò)濾泡菜汁不同過(guò)濾時(shí)間的微生物菌落總數(shù)變化

        微生物的截留率也是評(píng)價(jià)陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁效果的因素之一,0.05 μm陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁除菌率隨時(shí)間的變化結(jié)果見(jiàn)圖2。

        由圖2可知,原泡菜汁中細(xì)菌、乳酸菌、真菌的菌落總數(shù)分別降低為55000,673500,3705 CFU/mL;膜處理起始階段,泡菜汁中細(xì)菌、乳酸菌、真菌的菌落總數(shù)分別為75,240,6 CFU/mL,細(xì)菌、乳酸菌、真菌的去除率分別為99.96%、99.96%、99.99%, 3,6,9,12,15 h與1 h相比泡菜汁中細(xì)菌的截留率分別降低為0.0008%、0.01%、0.017%、0.03%、0.04%;泡菜汁中乳酸菌的截留率分別降低為0.010%、0.012%、0.018%、0.027%、0.04%;泡菜汁中真菌的截留率分別降低為0.005%、0.007%、0.011%、0.013%、0.0133%。由此可知,0.05 μm陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁,隨著過(guò)濾時(shí)間的延長(zhǎng),膜過(guò)濾除菌率降低,隨著膜污染程度的加深,陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁的除菌效果也隨之降低。

        2.3 泡菜汁過(guò)濾中膜污染微生物的分離鑒定

        從污染的陶瓷膜中分別分離出細(xì)菌和真菌16株和5株,最終選取9株細(xì)菌及4株真菌的DNA為模板,細(xì)菌以27F和1492R為引物進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增,真菌以ITS1和ITS4為引物進(jìn)行ITS擴(kuò)增,并將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),見(jiàn)圖3。

        圖3 PCR擴(kuò)增紫外凝聚成像圖Fig.3 UV agglutination images amplified by PCR

        由圖3 可知,9株細(xì)菌及4株真菌的擴(kuò)增產(chǎn)物都是條帶明亮清晰且單一不拖尾,無(wú)非特異擴(kuò)增現(xiàn)象,且細(xì)菌菌株的16S rRNA序列片段大小均在1200~1400 bp左右,真菌菌株的ITS序列片段大小均在500~700 bp左右,滿(mǎn)足測(cè)序要求。

        2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

        將9株細(xì)菌和4株真菌采用GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)在NCBI上根據(jù)BLAST檢索搜索與上述所測(cè)得序列相似度較高的16S rRNA和ITS序列,分析比較后刪除相同的序列,最終篩選最相似的16S rRNA和ITS序列與供試菌株的序列采用NJ法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

        細(xì)菌結(jié)果見(jiàn)圖4。

        圖4 基于16S rRNA序列的9株細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 9 strains of bacteria based on 16S rRNA sequence

        由圖4可知,細(xì)菌的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)各主分支的自舉支持率范圍在67%~100%,且各主分支的后驗(yàn)概率大部分在0.90~1.0之間。最終將9株供試菌株歸為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、放線(xiàn)菌(Actinobacteriabacterium)、馬賽短芽孢桿菌(Brevibacillusmassiliensis)、絲狀芽孢桿菌(Bacillusfilamentosus)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、發(fā)酵黏液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)及乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)。

        真菌結(jié)果見(jiàn)圖5。

        圖5 基于ITS序列的4株真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of 4 strains of fungi based on ITS sequence

        由圖5可知,真菌的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)各主分支的自舉支持率在100%,且各主分支的后驗(yàn)概率大部分在0.95~1.0之間。最終將4株供試菌株歸為卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。

        2.4 膜過(guò)濾泡菜汁不同過(guò)濾時(shí)間的污染膜SEM分析

        泡菜汁膜過(guò)濾不同時(shí)間(新膜、3,6,9,12,15 h),取不同過(guò)濾時(shí)間下獲得的膜管進(jìn)行SEM分析,結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。被污染的膜表面無(wú)明顯的結(jié)垢,但膜內(nèi)表面呈淺淺的黃色,與膜過(guò)濾后的泡菜汁顏色相似,推測(cè)可能是泡菜汁中的色素部分被截留到膜表面。采用SEM觀察泡菜汁膜過(guò)濾不同時(shí)間內(nèi)膜被污染的情況。

        新的陶瓷膜及不同過(guò)濾時(shí)間陶瓷膜橫斷面的SEM圖見(jiàn)圖6中A~F。由圖6中A可知,新的陶瓷膜的橫斷面中會(huì)有部分微小顆粒,可能是在脆斷過(guò)程中膜管本身材料抖落所致。0.05 μm的陶瓷膜內(nèi)為非均勻結(jié)構(gòu),且最大孔徑為0.42 μm,因此泡菜汁中的小分子物質(zhì)以及部分粒徑小于0.42 μm的物質(zhì)能夠透過(guò)陶瓷膜;范圍在0.05~0.42 μm的小分子物質(zhì)被截留或吸附在膜孔內(nèi),堵塞膜孔造成膜污染;而被截留的物質(zhì)粒徑大于0.42 μm。由圖6中B~F可知,隨著過(guò)濾的進(jìn)行,新膜和污染膜表面有明顯的區(qū)別,泡菜汁中的小分子物質(zhì)或懸浮物明顯吸附或沉積在膜表面以及膜孔內(nèi),致使膜橫斷面孔徑堵塞越來(lái)越嚴(yán)重,且時(shí)間越長(zhǎng),橫斷膜面堆積的雜質(zhì)越多。

        新的陶瓷膜及不同過(guò)濾時(shí)間陶瓷膜內(nèi)膜表面的SEM圖見(jiàn)圖7中A~F。由圖7中A可知,新的陶瓷膜內(nèi)膜表面由非均勻、隨機(jī)分布的微粒任意堆積而成,陶瓷膜的孔徑就是由于微粒與微粒之間的非緊密結(jié)合形成的。由圖7中B可知,陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁運(yùn)行3 h后的污染膜孔徑表面覆蓋著少量的污染物,且在膜孔隙中有疑似橢圓形及桿狀的微生物。運(yùn)行6,9,12,15 h后的污染膜管上也均有此現(xiàn)象出現(xiàn),且陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁運(yùn)行時(shí)間越長(zhǎng),膜表面的污染物質(zhì)就越多,膜面污染越嚴(yán)重。運(yùn)行15 h后的陶瓷膜結(jié)果見(jiàn)圖7中F,雖然膜表面覆蓋著許多的污染物,但仍然能發(fā)現(xiàn)膜孔的存在,說(shuō)明陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁運(yùn)行15 h后的膜污染還未形成濾餅層污染,主要的污染形式仍為膜孔內(nèi)污染。

        2.5 泡菜汁過(guò)濾中膜污染官能團(tuán)分析

        采用FTIR光譜儀分析泡菜汁陶瓷膜過(guò)濾中被污染陶瓷膜的官能團(tuán),結(jié)果見(jiàn)圖8。

        圖8 不同運(yùn)行時(shí)間后陶瓷膜傅里葉紅外光譜Fig.8 FTIR spectra of ceramic membrane after different operation time

        結(jié)果顯示:FTIR光譜儀分析表明陶瓷膜過(guò)濾泡菜汁中,引起膜污染的主要物質(zhì)有蛋白質(zhì)、多糖、泡菜汁中的酚類(lèi)物質(zhì)以及少量脂類(lèi)化合物。

        2.6 膜過(guò)濾時(shí)間對(duì)泡菜汁中胞外聚合物含量的影響

        泡菜汁膜過(guò)濾不同時(shí)間(1,3,6,9,12,15 h),泡菜汁中EPS含量分析結(jié)果見(jiàn)圖9。

        圖9 泡菜汁中蛋白含量隨時(shí)間的變化Fig.9 The changes of protein content in pickle juice with time

        由圖9可知,原泡菜汁中EPS含量為13.73 mg/mL,經(jīng)膜處理后,泡菜汁中EPS含量顯著下降。膜過(guò)濾3,6,9,12,15 h后泡菜中EPS分別增加了1.28%、9.09%、10.28%、19.56%、25.15%,其中SEPS含量分別增加了7.80%、18.44%、24.67%、84.47%、97.79%;TB-EPS含量分別增加了16.95%、20.39%、25.14%、30.06%、55.17%;LB-EPS含量分別增加了10.14%、18.12%、27.42%、36.48%、44.75%。由此可知,隨著膜過(guò)濾的進(jìn)行,結(jié)合態(tài)EPS含量大于SEPS含量,且泡菜汁中疏水性大分子芳香族蛋白質(zhì)主要在TB-EPS中,LB-EPS中主要是小分子的有機(jī)酸[25]。隨著過(guò)濾的進(jìn)行,泡菜汁中EPS含量增加,由于EPS的雙層結(jié)構(gòu)將微生物包裹起來(lái),能夠在極端的條件下對(duì)泡菜汁中的微生物起到良好的保護(hù)作用;泡菜汁中的蛋白質(zhì)和多糖類(lèi)物質(zhì)被截留,不僅為微生物的生長(zhǎng)代謝提供了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而且EPS的組成及成分比例差異被附著在微生物及其微生物絮凝物表面,因此會(huì)對(duì)微生物及其微生物絮凝物表面的親水性和疏水性等特性產(chǎn)生不同程度的影響[26-27],這些均能促使膜通量降低,膜污染越來(lái)越嚴(yán)重。

        3 結(jié)論

        0.05 μm孔徑膜在最適條件下過(guò)濾泡菜汁,膜運(yùn)行至15 h時(shí),膜通量降低43.49%;微生物截留率降低0.4%;從污染膜管上檢出的微生物細(xì)菌主要是芽孢桿菌、放線(xiàn)菌和乳桿菌;真菌為卡尼克酵母菌和庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母菌。膜孔內(nèi)和膜內(nèi)表面污染,膜運(yùn)行時(shí)間越長(zhǎng),膜管污染越嚴(yán)重。引起膜污染的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)、多糖、泡菜汁中的酚類(lèi)物質(zhì)以及少量脂類(lèi)化合物。運(yùn)行15 h時(shí),EPS含量增加25.15%。膜過(guò)濾泡菜汁連續(xù)運(yùn)行15 h,若不及時(shí)清洗,不僅過(guò)濾效果低,甚至?xí)斐赡す軋?bào)廢,增加生產(chǎn)成本。因此,膜過(guò)濾泡菜汁的最適周期為15 h。

        猜你喜歡
        污染
        河流被污染了嗎?
        什么是污染?
        什么是污染?
        堅(jiān)決打好污染防治攻堅(jiān)戰(zhàn)
        堅(jiān)決打好污染防治攻堅(jiān)戰(zhàn)
        可以喝的塑料:污染解決之道?
        飲用水污染 誰(shuí)之過(guò)?
        食品界(2016年4期)2016-02-27 07:36:15
        對(duì)抗塵污染,遠(yuǎn)離“霾”伏
        都市麗人(2015年5期)2015-03-20 13:33:49
        P265GH低合金鋼在模擬污染大氣環(huán)境中的腐蝕行為
        污染防治
        江蘇年鑒(2014年0期)2014-03-11 17:09:46
        欧美性受xxxx狂喷水| 天天鲁在视频在线观看| 欧美aa大片免费观看视频| 自拍亚洲一区欧美另类| 久久久人妻丰满熟妇av蜜臀| 精品国产成人av久久| 色噜噜av亚洲色一区二区| 中国一级免费毛片| 按摩女内射少妇一二三区| 高清日韩av在线免费观看| 国产精品爽爽v在线观看无码| 亚洲一区中文字幕在线电影网 | 国产乱人伦偷精品视频免观看| 熟女无套内射线观56| 国产成人啪精品午夜网站| 中文字幕你懂的一区二区| 国产成人自拍高清在线| 国产成人精品电影在线观看| 综合色天天久久| av免费在线播放一区二区| 色婷婷一区二区三区四区成人网| 成人片黄网站色大片免费观看cn| 久久久久久无中无码| 男女啪啪啪的高清视频| 久久精品国产自在天天线| 亚洲日韩欧美国产另类综合| 日本一区二区三区在线| 国产日产一区二区三区四区五区| 国产女人高潮叫床视频| AV永久天堂网| 伊人影院成人在线观看| 精品视频一区二区三区在线观看 | 精品女同一区二区三区在线播放器 | 国产丰满乱子伦无码专| 精品一级一片内射播放| www射我里面在线观看| 久久精品国产热| 亚洲码专区亚洲码专区| 国内精品久久久久久久97牛牛 | 肥老熟妇伦子伦456视频| 亚洲av日韩av永久无码色欲|