洪奕，夏海華，田潔萍，張淑梅，于沖，田緣，閆更軒，潘鈺*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150006；2.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010)

納豆激酶(nattokinase，NK)是一種具有高效溶栓作用的絲氨酸蛋白酶，具有被開發(fā)成高效纖溶藥物或保健食品的潛力，閆泉香等[1]研究發(fā)現(xiàn)納豆激酶在體內(nèi)外均表現(xiàn)出強大的溶栓活性，且對新舊形成的血栓均有作用。傳統(tǒng)工業(yè)上產(chǎn)納豆激酶的方法多是以大豆為原料進行固體或液體發(fā)酵，固體發(fā)酵可采用的物料比較多，降低成本的同時還可以減少環(huán)境污染[2-3]。豆粕是大豆加工制油過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，目前豆粕主要應用在動物飼料方面[4]，若能利用成本較低的豆粕發(fā)酵生產(chǎn)出具有高附加值的生物產(chǎn)品，既能降低產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵成本，又能提高豆粕的利用率和價值。孫巖等[5]以豆粕為唯一培養(yǎng)基成分，利用正交試驗優(yōu)化了固態(tài)發(fā)酵條件，比采用大豆為培養(yǎng)基獲得的酶活力高50%左右。

本研究以前期實驗室篩選的高產(chǎn)納豆激酶枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)SWS01為發(fā)酵菌種，以豆粕為培養(yǎng)基，采用固體發(fā)酵方法產(chǎn)NK，通過單因素試驗探究初始含水量、接種量、干豆粕裝量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和pH值對NK酶活的影響，再利用響應面法[6-7]探究最佳發(fā)酵工藝，以期獲得較高酶活力的NK，為進一步利用豆粕進行固體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)納豆激酶奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)SWS01：實驗室從日本納豆中篩選獲得；豆粕：鶴崗市善成食品有限公司。

1.2 試劑

牛肉浸膏、蛋白胨、蔗糖、氯化鈉、瓊脂等：哈爾濱市南崗區(qū)艾默爾生物技術(shù)耗材經(jīng)銷部；尿激酶：中國食品藥品檢定研究院；牛纖維蛋白原、凝血酶、瓊脂糖：Sigma公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

ZQLY-300V振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；Olympus-CH顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；JE203GE電子天平、FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；CCL-170B -8二氧化碳培養(yǎng)箱 新加坡藝思高科技有限公司；PURA22電熱恒溫水浴箱 瑞軒電子科技(上海)有限公司；Spectrum SP-1920紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；ZHJH-C1115C超凈工作臺 北京中儀友信科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 種子液制備

菌種活化：將枯草芽孢桿菌菌株接至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃，24 h，進行菌種活化，挑取1環(huán)活化好的的菌株接入50 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，振蕩培養(yǎng)14～18 h，鏡檢確認無雜菌后可用于固體發(fā)酵，此為固體發(fā)酵種子液。

1.4.2 固體發(fā)酵

250 mL三角瓶中分裝一定量的豆粕，封口，滅菌，無菌操作接入相應體積種子液，封口并搖勻，置于無菌恒溫培養(yǎng)箱中進行固體發(fā)酵，37 ℃發(fā)酵24 h，期間或發(fā)酵結(jié)束取樣并測定NK酶活。

1.4.3 NK酶活的測定

發(fā)酵結(jié)束后，每克固體發(fā)酵成熟物加入5 mL 0.9%生理鹽水，4 ℃搖床浸提4 h后以4500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，上清液即為固體發(fā)酵粗酶溶液；采用纖維蛋白平板法[8]測定納豆激酶活性，采用電子游標卡尺測定溶解圈直徑。配制不同濃度的尿激酶溶液(20～100 U/mL)，以尿激酶溶解圈面積為橫坐標、NK酶活為縱坐標，繪制標準曲線。測定樣品酶活時用溶解圈直徑測量值代入回歸方程即可求得NK酶活大小。

1.4.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

在其他基本發(fā)酵條件固定的情況下，依次選取基質(zhì)初始含水量(25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%)、接種量(3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%)、豆粕裝量(50，60，70，80，90，100，110 g/250 mL)、發(fā)酵溫度(25，30，35，40，45，50 ℃)、發(fā)酵時間(3～48 h，每隔3 h測定NK酶活)、初始pH值(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)，考察其對NK活性的影響。

1.4.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選出影響NK酶活的顯著性因素進行響應面設(shè)計，以NK酶活(Y)為響應值，以接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)3個因素為自變量，應用Design-Expert設(shè)計模型，進行三因素三水平Box-Behnken響應面試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 枯草芽孢桿菌SWS01利用豆粕發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken響應面試驗因素及水平Table 1 Optimization of Box-Behnken response surface test factors and levels by Bacillus subtilis SWS01 using soybean meal fermentation conditions

1.4.6 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有試驗數(shù)據(jù)取3次重復試驗的平均值同時計算標準誤差。用GraphPad Prism進行單因素方差分析并作圖，響應面結(jié)果利用Design Expert 8.0.6進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿激酶標準曲線

經(jīng)游標卡尺測得并計算尿激酶標準品溶液(20, 40, 60, 80, 100 U/mL)的牛纖維蛋白溶解圈面積依次為223.2, 271.22, 319.98, 362.72, 410.98 mm2，孵育結(jié)果見圖1。

圖1 尿激酶標準品和樣品溶解圈Fig.1 The dissolving circles of urokinase standard samples and samples

以纖維蛋白溶解圈面積為橫坐標、尿激酶酶活為縱坐標，繪制尿激酶標準曲線，見圖2。

圖2 尿激酶標準曲線Fig.2 Urokinase standard curve

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 基質(zhì)初始含水量對產(chǎn)酶的影響

以干豆粕90 g/250 mL、接種量6%、pH自然為初始培養(yǎng)條件，35 ℃發(fā)酵24 h，考察培養(yǎng)基基質(zhì)初始含水量分別為25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%時的NK酶活，結(jié)果見圖3。

圖3 初始含水量對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of initial water content on enzyme production

基質(zhì)含水量是固體發(fā)酵中的一個重要影響因素，基質(zhì)含水量小，菌體會在發(fā)酵后期由于水分蒸發(fā)變干燥而難以生長，造成產(chǎn)酶下降；基質(zhì)含水量大，菌體生長會受產(chǎn)生的液膜影響，同時易染菌，不利于次級代謝物的產(chǎn)生。由圖3可知，隨著基質(zhì)含水量的增大，NK酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在初始含水量為55%時NK酶活性最大，為豆粕在室溫下自然浸泡至飽和狀態(tài)下的百分含量。

2.2.2 接種量對產(chǎn)酶的影響

以干豆粕90 g/250 mL、基質(zhì)初始含水量55%、pH自然為初始培養(yǎng)條件，35 ℃發(fā)酵24 h，考察接種量分別為3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%時的NK酶活，結(jié)果見圖4。

圖4 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on enzyme production

由圖4可知，隨著接種量在3%～10%范圍內(nèi)增加，菌株固體發(fā)酵產(chǎn)NK酶活的量也隨之呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當接種量為5%～6%時，NK酶活增加較明顯，而當接種量大于6%時，NK酶活開始下降。因為加入的是種子液，過多加入液體會造成基質(zhì)水分含量增加，不利于固體發(fā)酵過程中的傳質(zhì)和傳熱，故最佳接種量為6%。

2.2.3 豆粕裝量對產(chǎn)酶的影響

以接種量6%、基質(zhì)初始含水量55%、pH自然為初始培養(yǎng)條件，35 ℃發(fā)酵24 h，考察豆粕裝量分別為50，60，70，80，90，100，110 g/250 mL時的NK酶活，結(jié)果見圖5。

圖5 豆粕裝量對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of soybean meal loading volume on enzyme production

固體發(fā)酵過程中豆粕裝量直接影響基質(zhì)中氧的含量，裝量過少，菌體營養(yǎng)不夠，產(chǎn)酶活性低；裝量過大，豆粕會非常黏稠，也不利于產(chǎn)酶。由圖5可知，豆粕裝量為90 g/250 mL時NK酶活最大。

2.2.4 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

以干豆粕90 g/250 mL、基質(zhì)初始含水量55%、接種量6%、pH自然為初始培養(yǎng)條件，固體發(fā)酵24 h，考察發(fā)酵溫度分別為25，30，35，40，45，50 ℃時的NK酶活，結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on enzyme production

溫度高于60 ℃時納豆激酶會失活，試驗選取25～50 ℃范圍進行研究，由圖6可知，NK在35 ℃時酶活最高，溫度高于或低于35 ℃酶活均降低，固體發(fā)酵過程中反應器內(nèi)外溫差和豆粕基質(zhì)料層溫差對發(fā)酵結(jié)果的影響很大，在實際生產(chǎn)時，可通入無菌空氣和定時翻拌物料來降溫，進而增加目標產(chǎn)物[9]。本試驗NK的最適發(fā)酵溫度為35 ℃。

2.2.5 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

以干豆粕90 g/250 mL、接種量6%、基質(zhì)初始含水量55%、pH自然為初始培養(yǎng)條件，35 ℃發(fā)酵，每隔3 h取樣并保存于4 ℃冰箱中待測，考察發(fā)酵時間為3～48 h時的NK酶活，結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of fermentation time on enzyme production

由圖7可知，發(fā)酵初期，NK活性隨著時間的增加而迅速增長，發(fā)酵18 h后，NK活性趨于穩(wěn)定，樣品鏡檢發(fā)現(xiàn)有芽孢產(chǎn)生，發(fā)酵24 h時芽孢最多，36 h后NK產(chǎn)量緩慢下降，發(fā)酵時間24 h為最佳。

2.2.6 初始pH對產(chǎn)酶的影響

以干豆粕90 g/250 mL、接種量6%、基質(zhì)初始含水量55%、35 ℃發(fā)酵24 h，考察發(fā)酵浸泡水pH分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0時的NK酶活，結(jié)果見圖8。

圖8 初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of initial pH on enzyme production

由圖8可知，不同pH條件下對產(chǎn)酶的影響較小，浸泡水pH為7時，酶產(chǎn)量最高，達到3492 IU/g。pH為6.0和7.0時無統(tǒng)計學差異，pH過高或過低均會導致酶產(chǎn)量降低，自然條件下pH值約為6～7，因此不需要調(diào)節(jié)浸泡水pH。

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

枯草芽孢桿菌菌株發(fā)酵豆粕產(chǎn)納豆激酶的最優(yōu)單因素條件：豆粕裝量 90 g/250 mL、初始含水量55%、接種量6%、35 ℃恒溫培養(yǎng)24 h、初始pH值為自然狀態(tài)。在單因素試驗基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以接種量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)這3個因素為自變量，以NK酶活(Y)為響應值，設(shè)計三因素三水平的試驗。響應面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應面試驗設(shè)計與試驗結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

續(xù) 表

表3 BBD方差分析結(jié)果Table 3 BBD variance analysis results

利用軟件得到的二次多項式回歸方程為：

Y=5601.80+289.50A+273.25B+282.75C+126.25AB+53.25AC+16.25BC-721.53A2-855.03B2-639.02C2。

由表3可知，回歸方程模型的P<0.01，由此可知該模型二次項顯著，失擬項不顯著(P=0.4768>0.05)，表明建立的模型中并沒有異常數(shù)據(jù)。

綜上所述，該回歸方程為芽孢桿菌豆粕固體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶提供了一個合理模型，利用 Design Expert軟件繪制等高線和響應面圖，見圖9。

通過對回歸方程進行分析，預測出最佳發(fā)酵工藝條件為：接種量6.22%、發(fā)酵溫度35.90 ℃、發(fā)酵時間25.40 h，此條件下得出的NK酶活理論值為5691.67 IU/g。 根據(jù)實際情況調(diào)整預測值，進行驗證試驗，NK活力實際值為5421 IU/g，與預測值接近，表明利用響應面優(yōu)化得到的以豆粕為原料的固體發(fā)酵工藝條件合理可靠。

3 結(jié)論

利用單因素試驗結(jié)合響應面分析方法對固體發(fā)酵工藝參數(shù)進行優(yōu)化，確定了以豆粕為培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的工藝：90 g新鮮的食品級豆粕分裝于250 mL錐形瓶中，經(jīng)過115 ℃滅菌25 min，以6%的接種量將液態(tài)種子液接入培養(yǎng)基，加入無菌蒸餾水使總含水量達到55%，在36 ℃可控溫控濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵25 h，發(fā)酵物以5倍無菌生理鹽水在4 ℃搖床浸提4 h，4500 r/min離心20 min，取上清液測定酶活，枯草芽孢桿菌SWS01固體發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶酶活達到5421 IU/g。

鑒于納豆激酶具有公認的眾多保健作用[10-12]，且最新研究發(fā)現(xiàn)納豆有對抗細菌及新冠病毒的效果[13-14]。納豆的主要活性成分為納豆激酶，因此利用較低廉的豆粕為原料，生產(chǎn)具有較高附加值的納豆激酶，在開發(fā)保健食品及調(diào)味品方面有廣闊的應用前景。