李澤林，王秋婷，桂海佳，谷大海，王雪峰，肖智超，王桂瑛，普岳紅，范江平

(云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術學院，昆明 650201)

虎掌菌又名棗翹鱗肉齒菌(Sarcodonimbricatus(L.) P. Karst.)，屬于傘菌綱(Agaricomycetceae)、革菌目(Thelephoraceae)、齒菌科(Bankeraceae)，因菌蓋有塊狀鱗片，形狀像虎爪而得名，呈黑褐色[1]?；⒄凭馕兜来己穹枷?，礦質元素豐富，蛋白含量高，脂肪含量低，含有比例適宜的多種人體必需氨基酸與非必需氨基酸，含有一定濃度的呈味氨基酸等，可入藥，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、增強免疫力等功能[2-3]。雞骨是雞肉加工中產(chǎn)生的一大副產(chǎn)物，在我國年產(chǎn)生近2000萬噸的各類畜禽骨中占很大的比重，含有豐富的蛋白質(含量可達16.3%，與等量雞肉相似)，有機物約16%～33%，無機物約25%～26%，脂肪含量約8%～12%和水分含量約58%～62%[4-5]。但是，雞骨利用率比較低，酶解和發(fā)酵是目前可利用處理的主要方法手段。

目前，調味基料的風味優(yōu)劣判別大多還是直接通過感官評價進行評估和判定，有一定的主觀性和局限性，且易受測評人員個人喜好的影響[6]。電子鼻是通過傳感器陣列的響應強度大小來分析評估樣品中的揮發(fā)性氣味，不僅可判別氣味差異，而且可對被測樣品中的成分進行定性分析，結果更客觀，在食品風味分析中得到廣泛應用[7-8]。鄭舒文等[9]通過電子鼻和電子舌技術精確評定了鱈魚的鮮度。Tian Huaixiang等[10]運用電子鼻技術分析評價了酸奶基質中雙乙酰、乙醛和乙酰乙素的協(xié)同嗅覺效應。

因此，本研究擬在單因素試驗基礎上進行正交試驗設計，優(yōu)化虎掌菌-雞骨酶解液美拉德反應工藝，制作風味優(yōu)良的菌骨調味基料；然后結合TAV、PCA和LDA對反應前后酶解液的游離氨基酸和電子鼻結果進行風味差異評估，以期為菌骨調味料的研發(fā)提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞骨(白羽肉雞)：由云南農(nóng)業(yè)大學實驗雞場提供；虎掌菌：新鮮、無病蟲害、無瑕疵，購于云南省易門縣，用鼓風干燥箱烘干，用打粉機粉碎，放置于干燥器中備用。

動物蛋白水解酶(食品級，40000 U/g)、風味蛋白酶(食品級，50000 U/g)：浙江一諾生物科技有限公司；木糖(食品級)：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖(食品級)：中國醫(yī)藥集團化學試劑公司；硫胺素(食品級)：上海曙光生物化學制品廠；L-半胱氨酸鹽酸鹽(食品級)：Biosharp生物科技公司。

1.2 設備

PL303型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3C型雷磁pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；S-433(D)型氨基酸自動分析儀 德國Sykam公司；T6型新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PG-150型碎骨機 諸城市廣優(yōu)機械科技有限公司；PEN3型電子鼻 德國Airsense公司。

1.3 工藝流程

雞骨→加水勻漿→調節(jié)pH至7.0→加入動物蛋白酶、風味蛋白酶→55 ℃水浴酶解4.4 h→煮沸滅酶30 min→5000 g離心15 min→取上清液備用。

虎掌菌→加水勻漿→調節(jié)pH至7.0→加入木瓜蛋白酶、風味蛋白酶→50 ℃水浴酶解5.1 h→煮沸滅酶30 min→5000 g離心15 min→取上清液備用。

復合的酶解液→加入還原糖、硫胺素、L-半胱氨酸鹽酸鹽→調節(jié)pH→充分混勻→美拉德反應→冷卻。

1.4 單因素試驗

以褐變度和感官評分為指標，分別選取復合酶解液(雞骨酶解液∶虎掌菌酶解液)比例(3∶2、2∶3、1∶1、1∶4)、pH(4，5，6，7)、溫度(90，100，110，120 ℃)、時間(50，70，90，110 min)、還原糖添加量(1%、2%、3%、4%)、葡萄糖與木糖比例(1∶0、1∶1、0∶1、3∶1)、硫胺素添加量(1%、2%、3%、4%)、L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量(1%、2%、3%、4%)進行單因素試驗。

1.5 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，設計正交試驗，其因素水平表見表1。

表1 正交試驗設計表Table 1 Design of orthogonal test

1.6 褐變程度檢測

根據(jù)劉培基等[11]的方法并稍加修改，檢測菌骨酶解液美拉德反應褐變程度；將1 mL的美拉德反應液稀釋至100 mL，以未反應的酶解液為參比，用紫外分光光度計于420 nm處測定吸光值。

1.7 感官評價

選10名食品專業(yè)的研究生按照評分表進行感官評分，將美拉德反應產(chǎn)物于50 ℃預熱10 min后進行評定。滿分為15分，評分標準見表2。

表2 感官評分標準Table 2 Sensory scoring criteria

1.8 游離氨基酸測定

菌骨酶解液美拉德反應前后游離氨基酸的測定：根據(jù)GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》的方法使用氨基酸自動分析儀進行檢測。

1.9 味覺活性值計算

參考Zhou Fen等[12]的方法，使用菌骨酶解液中游離氨基酸的味覺活性值(taste activity value，TAV)評價各呈味氨基酸對美拉德反應前后菌骨酶解液滋味的貢獻。按下式計算TAV：

TAV=樣品濃度/味覺閾值。

1.10 電子鼻檢測

參考Tian Huaixiang等[13]的方法并稍加修改，對美拉德反應前后菌骨酶解液進行檢測。預熱PEN3型電子鼻儀器30 min，啟動自動清洗傳感器，清洗時間2 min，采用10個傳感器對樣品進行檢測。吸取20 mL的樣液置于待測容器瓶中，密封靜置20 min后，以300 mL/min的流速對樣品進行測定。傳感器的識別性能見圖1。

圖1 電子鼻傳感器性能Fig.1 The performances of electronic nose sensors

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用電子鼻Winmuster軟件進行相應PCA和LDA分析，香味雷達圖譜通過Winmuster獲取響應值后使用Excel 2016制作。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 虎掌菌和雞骨酶解液液體比例對美拉德反應的影響

在pH 6.0、溫度110 ℃、時間90 min、還原糖添加量3%、液體比例1∶1，硫胺素添加量3%、L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量2%的條件下，由圖2中a可知，復合液體不同的比例對褐變程度具有一定影響，當二者比例為1∶1時，酶解液褐變顏色效果最好，并且風味感官評分達到13.9分，有濃郁的肉香味，含有較強鮮味。因此，選擇1∶1為最適比例。

2.1.2 pH對美拉德反應的影響

控制液體比例為1∶1，其他條件不變。由圖2中b可知，隨著pH的上升，褐變程度OD420 nm值明顯上升，反應液的顏色逐漸加深且感官評分逐漸增加；但當pH增加至7.0時，美拉德反應劇烈，顏色變黑，出現(xiàn)嚴重的難以接受的糊臭味。因此，選擇pH 6.0為最優(yōu)值。

2.1.3 溫度對美拉德反應的影響

控制pH為6.0，其他條件不變。由圖2中c可知，隨著溫度不斷升高，褐變程度OD420 nm值也逐漸上升，當溫度為110 ℃時，感官評分較高；這是因為適當?shù)母邷貢碳し磻?，反應速率加快，釋放調味基料的香氣。當溫度超過110 ℃時，雖然褐變程度OD420 nm值較高，但樣品風味較差。因此，綜合感官評定，選擇110 ℃為最適溫度。

2.1.4 時間對美拉德反應的影響

控制溫度為110 ℃，其他條件不變。由圖2中d可知，隨著反應時間的增加，褐變程度OD420 nm值呈上升趨勢，反應液顏色加深；結合感官評價，當時間為90 min時，反應液顏色較好，產(chǎn)生的風味也較好，香味濃郁，并且含有鮮味；隨著時間的延長，反應液褐變程度加深，但是出現(xiàn)了較重的糊味。因此，選擇90 min為最適時間。

2.1.5 還原糖添加量對美拉德反應的影響

設定反應時間為90 min，其他條件不變。由圖2中e可知，隨著還原糖含量的不斷增加，反應液褐變程度呈現(xiàn)上升的趨勢，但當還原糖含量過高時，由于在高溫下長時間反應，液體出現(xiàn)了糊味以及苦味，顏色變深，感官評分降低。因此，選擇3%為最適還原糖添加量。

2.1.6 硫胺素添加量對美拉德反應的影響

由圖2中f可知，隨著硫胺素添加量的不斷增加，褐變程度OD420 nm值增大，當硫胺素添加量為3%時，感官評分最高，達到了12.3分，繼續(xù)增加硫胺素添加量，反應液出現(xiàn)糊臭味。因此，確定硫胺素最適添加量為3%。

2.1.7 L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量對美拉德反應的影響

控制硫胺素添加量為3%，其他條件不變。由圖2中g可知，隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增加，反應液的褐變程度呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢；反應液的感官評分在其添加量為2%時達到最大值，當超過2%時反應液開始出現(xiàn)硫臭味，肉香味變淡，同時開始出現(xiàn)苦味，破壞了原有的味道。綜合考慮，選擇最適L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為2%。

2.2 正交試驗結果分析

美拉德反應是一個復雜的反應過程，各種因素或反應條件都能夠影響該反應，所以需要在單因素試驗結果的基礎上進一步優(yōu)化設計并進行驗證?；趩我蛩卦囼灥慕Y果，通過正交試驗進一步優(yōu)化工藝條件，得到的正交試驗設計及結果見表3。影響美拉德反應液褐變程度(OD420 nm)變化的主次順序為：酶解溫度>酶解時間>硫胺素添加量>還原糖添加量>pH>L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量>液體比；其中，影響最顯著的因素是酶解溫度，影響最小的是液體比。根據(jù)R值可知，影響反應液感官評分變化的主次順序為時間>溫度>L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量>硫胺素添加量>液體比>pH>還原糖添加量；其中，時間對感官分數(shù)的影響最顯著，還原糖添加量對感官分數(shù)的影響最小。

表3 正交試驗設計結果Table 3 The design results of orthogonal test

續(xù) 表

在正交試驗中，OD420 nm表示褐變程度，其值越高反應液顏色越深；感官分數(shù)表示反應液的風味。因此，綜上所述，本研究以感官分數(shù)為主要指標，OD420 nm為次指標，根據(jù)正交試驗結果，得到最佳工藝參數(shù)為：A1B2C2D2E2F2G2，即pH為4.5，溫度為110 ℃，液體比例為1∶1，時間為90 min，還原糖添加量為3%，硫胺素添加量為3%，L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為2%。在此工藝條件下得到的反應液感官評分為13.6，褐變度OD值為0.1，香味濃郁，色澤誘人。

2.3 驗證試驗

基于正交試驗最優(yōu)結果，進行3次重復驗證試驗，得到最優(yōu)條件下美拉德反應后的菌骨酶解液感官評分為(12.5±2.3)分，褐變程度OD值為0.132±0.041，與正交試驗結果相近且無顯著性差異，證明此優(yōu)化工藝可行。

2.4 美拉德反應前后菌骨酶解液中游離氨基酸含量及TAV的差異分析

游離氨基酸是美拉德反應的主要前體物，酶解可釋放樣品中的游離氨基酸[17]；美拉德反應的過程中會消耗氨基酸，合成新的風味物質，但是因Strecker降解、肽的降解和糖與氨基酸的交聯(lián)反應的存在也會增加美拉德反應液中游離氨基酸含量[18]。根據(jù)游離氨基酸的呈味特性分類，可將其分為鮮味、甜味和苦味氨基酸三大類。由表4可知，美拉德反應后游離氨基酸的總含量顯著增加(P<0.05)；其中，鮮味氨基酸含量從4062.36 mg/kg顯著減少至1979.09 mg/kg，甜味和苦味氨基酸含量在反應后均呈現(xiàn)上升趨勢，且三者終含量以苦味氨基酸含量最高，為3452.76 mg/kg，含量差距比反應前小。

表4 菌骨酶解液美拉德反應前后游離氨基酸含量、閾值、呈味特性及TAV值Table 4 The free amino acids' content, thresholds, flavor characteristics and TVAs in fungus-bone enzymatic hydrolysate before and after Maillard reaction

續(xù) 表

化合物對滋味的貢獻可采用TAV進行量化評估，一般認為當TAV>1時，該化合物對樣品滋味有貢獻；當TAV<1時，對樣品滋味貢獻小或者無貢獻[19]。由表4可知，菌骨液美拉德反應前后所有閾值參考的游離氨基酸的TAV均大于1，表明這些氨基酸對菌骨液滋味貢獻較大，其中反應前后對滋味貢獻最大的均為谷氨酸，TAV分別為112.35和41.96，其次為呈苦味的賴氨酸，TAV分別為32.86和19.11。但是有研究表明，呈苦味的氨基酸不具備味覺活性，容易使甜味和鮮味物質被掩蓋，而且谷氨酸可以提供強烈的鮮味、精氨酸與谷氨酸協(xié)同作用具有令人愉快的整體味道[20-21]，這可以使菌骨液中含量較高的苦味氨基酸呈味減弱。此外，美拉德反應后鮮味氨基酸天門冬氨酸(TAV：7.20)和甜味氨基酸絲氨酸(TAV：2.56)、精氨酸(TAV：4.37)的味覺活性值均有不同程度的增加。菌骨酶解液美拉德反應前后TAV>1的氨基酸含量的變換情況見圖3。

圖3 菌骨酶解液反應前后游離氨基酸含量變化熱圖Fig.3 Heat map of free amino acids' content in fungus-bone enzymatic hydrolysate before and after Maillard reaction

2.5 電子鼻結果分析

由圖4中雷達圖(a)和載荷圖(b)可知，美拉德反應前后的菌骨酶解液均對無機硫化物敏感的W1W、對乙醇敏感的W2S、對氮氧化合物敏感的W5S、對芳香成分及有機硫化物敏感的W2W傳感器的響應值較高，且美拉德反應后的樣品對所有傳感器的敏感度均超過反應前；反應后的樣品對無機硫化物的W1W傳感器敏感度迅速增加，響應值達到了最大值22。由圖4中b可知，距離(x=0，y=0)最遠的傳感器是W1W，說明此傳感器在第一和第二主成分的貢獻率最大；距y=0最遠的是傳感器W5S，說明此傳感器對第二主成分的貢獻率最大。結合圖4中a可以看出，美拉德反應后，風味輪廓明顯增加且圖中部分信號重合，說明兩個樣品之間的氣味特征存在相似[22]；W1W的響應值提高，說明美拉德反應產(chǎn)生了硫化物，一些硫化物可提供肉香風味[23]；美拉德反應過程中硫化物一部分來自硫胺素和L-半胱氨酸鹽酸鹽，但是它們的存在可以催化酶解液中含硫氨基酸的反應與分解，本研究中蛋氨酸的含量在美拉德反應后顯著降低(P<0.05)且半胱氨酸的含量由8.72 mg/kg顯著(P<0.05)增加至852.46 mg/kg，充分說明了美拉德反應后硫化物的產(chǎn)生絕大多數(shù)來自于游離氨基酸的反應與分解，這與左勇等[24]的研究結果類似。此外，W2S和W5S的響應值提高，說明美拉德反應后產(chǎn)生醇類和含氮化合物，與美拉德反應機理相一致。表明兩個菌骨酶解液樣品風味物質主要是醇類、硫化物和氮氧化合物等揮發(fā)性物質。

主成分分析法(PCA)是一種比較常用的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法，是能夠降低數(shù)據(jù)矩陣的維數(shù)，保留原始數(shù)據(jù)集的大部分信息并解釋各變量之間的相關性多元統(tǒng)計分析方法[25]。由圖4中c可知，美拉德反應前后的樣品第一主成分(PC1)的貢獻率為99.12%，第二主成分(PC2)的貢獻率為0.68%，兩個主成分的總貢獻率為99.8%，遠大于80%，說明該模型能夠充分反映樣品的整體信息，且差異主要在第一主成分上。美拉德反應后，主要沿PC1方向變化，說明其反應產(chǎn)生的揮發(fā)性風味物質變得豐富，美拉德反應前后的數(shù)據(jù)采集點所在的橢圓形區(qū)域分布在特定的區(qū)域中，說明反應前后它們之間存在一定的差別[26]。線性判斷(LDA)與主成分分析相比，更加注重樣品在空間分布狀態(tài)及各品種間的距離，可進一步分類[27]。由圖4中d可知，兩判別式的總貢獻率達到了100%，說明兩者間有明顯差異，能夠完全被區(qū)分；美拉德反應前后數(shù)據(jù)點分布在不同區(qū)域，沒有重疊現(xiàn)象，說明LDA能夠很好地區(qū)分反應前后的變化。綜上所述，無論PCA分析還是LDA分析，都能夠很好地將反應前后的香氣區(qū)分開，證明美拉德反應前后樣品的揮發(fā)性香氣有一定區(qū)別。

3 結論

虎掌菌味道鮮美，含有較多的游離呈味氨基酸，雞骨是雞肉生產(chǎn)中的一大副產(chǎn)物，也含有大量的蛋白質，兩者酶解后會釋放更多的游離氨基酸，可為美拉德反應提供前體物，用來制作調味基料。因此，本研究以虎掌菌和雞骨為原材料，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗設計，優(yōu)化菌骨酶解液美拉德反應工藝。得到最佳工藝條件為：pH為4.5，溫度為110 ℃，液體比例為1∶1，時間為90 min，還原糖添加量為3%，硫胺素添加量為3%，L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為2%。在此工藝條件下驗證得到的反應液感官評分為(12.5±2.3)分，褐變程度OD值為0.132±0.041，香味濃郁，色澤誘人，與模型值差異小。然后取美拉德反應前后的菌骨混合液進行游離氨基酸及電子鼻分析，結果表明，與反應前相比，反應后樣品鮮味氨基酸含量顯著從4062.36 mg/kg減少至1979.09 mg/kg，甜味和苦味氨基酸含量在反應后均呈現(xiàn)上升趨勢，且三者終含量以苦味氨基酸含量最高，為3452.76 mg/kg，其中反應前后樣品中共有13個游離氨基酸的TAV>1，對滋味貢獻最大的均為谷氨酸，TAV分別為112.35和41.96。電子鼻結果表明，美拉德反應前后樣品均對W1W、W2S和W5S傳感器敏感，表明兩者風味物質主要是硫化物、氮氧化合物和醇類等揮發(fā)性物質，但是美拉德反應后風味輪廓明顯增大。