孫行杰 吳忠娟 徐 英 崔麗靜

（1山東省龍口市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，煙臺(tái) 265701；2山東省招遠(yuǎn)市畢郭鎮(zhèn)黨群服務(wù)中心，招遠(yuǎn)265412；3新泰市林業(yè)保護(hù)發(fā)展中心，新泰 271200；4海陽市果業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，海陽 265100）

‘小白’是‘紅顏’草莓脫毒組培芽變品種，2012年獲世界草莓大會(huì)銀獎(jiǎng)，2014年通過北京種子中心審定[1]。果實(shí)長(zhǎng)圓錐形，果皮粉色或淺紅色，果肉純白色，可溶性固形物含量13%～16%，有黃桃口味，果個(gè)大，平均單果重41.2 g，最大單果重135 g，生長(zhǎng)旺盛，冬季連續(xù)結(jié)果性好，抗白粉病能力較強(qiáng)，667 m2產(chǎn)量3 500～5 000 kg。

近年來，國內(nèi)電商的快速發(fā)展在很大程度上改變了草莓傳統(tǒng)收購和銷售方式，‘小白’硬度大，耐儲(chǔ)藏，非常適合快遞運(yùn)輸，而且口感極佳，因此種植面積不斷擴(kuò)大。生產(chǎn)中，草莓苗很容易受到病毒侵染引起品種退化，導(dǎo)致產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、抗病性減弱等，嚴(yán)重影響草莓種植效益[2]。目前，病毒病尚無有效藥物可以治療，只能通過栽植脫毒種苗進(jìn)行防治。1974年日本大澤勝次首先證明草莓花藥培養(yǎng)植株為正常倍性，且可脫除病毒，并作為培育無病毒苗木的方法之一[3]；還有研究證明花藥培養(yǎng)所得的再生植株為脫毒植株，脫毒率為100%，可以省去病毒檢測(cè)過程[4]。本研究通過對(duì)‘小白’草莓花藥進(jìn)行低溫預(yù)處理、篩選合適的激素種類和配比的培養(yǎng)基，對(duì)草莓花藥愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)和分化，獲得‘小白’草莓脫毒原原種苗，再通過篩選適合的激素種類和配比的培養(yǎng)基對(duì)草莓叢生芽進(jìn)行增殖和生根培養(yǎng)，建立‘小白’草莓花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，獲得脫毒原原種苗，為草莓無病毒苗在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以草莓品種‘小白’適齡花蕾為材料。11月中旬晴天上午7：00～8：00取正常植株上直徑3～5 mm花蕾（鏡檢為單核靠邊期），置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 ‘小白’草莓花蕾預(yù)處理 自來水沖洗30 min→蒸餾水沖洗2～3次→放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中→密封后放入4 ℃冰箱中冷藏，低溫處理24 h、48 h和72 h，標(biāo)記為T1、T2和T3。對(duì)照不進(jìn)行低溫處理，標(biāo)記為CK。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo) 置于超凈工作臺(tái)上→75%酒精表面消毒30 s→無菌水沖洗2～3次→0.1% HgCl2消毒8 min→無菌水沖洗3次→去除花絲→剝?nèi)』ㄋ幯杆俳臃N于4種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（100 mL三角瓶）。花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+NAA 4.0 mg/L，分別記做M1、M2、M3和M4。共16個(gè)處理，每處理接種5瓶，每瓶接種10個(gè)花藥，重復(fù)3次。45 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 愈傷組織分化 將獲得的‘小白’草莓愈傷組織轉(zhuǎn)接至愈傷組織分化培養(yǎng)基中（500 mL培養(yǎng)瓶，下同），參照文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，花藥愈傷組織分化選用的培養(yǎng)基為：MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L；MS+6-BA 0.5mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA 0.2 mg/L；MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.2 mg/L，分別記做M5、M6、M7和M8。共4個(gè)處理，每處理10瓶，每瓶接種5個(gè)愈傷組織，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率。

1.2.4 叢生芽增殖 將獲得的‘小白’草莓叢生芽轉(zhuǎn)接至M5、M6、M7和M8培養(yǎng)基中，共4個(gè)處理，每處理接種3瓶，每瓶接種叢生芽1個(gè)，重復(fù)3次。接種20 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.5 生根 選用的生根培養(yǎng)基為：1/2MS、1/2MS+IBA 0.1 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L，分別記做M9、M10、M11。共3個(gè)處理，每處理5瓶，每瓶接種5株組培苗，重復(fù)3次。20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.6 培養(yǎng)條件 上述培養(yǎng)基除生根培養(yǎng)基中加入蔗糖20.0 g/L和活性炭0.5 g/L外，其它培養(yǎng)基中均加入蔗糖30.0 g/L，瓊脂5.5 g/L，pH值為5.8；除愈傷組織誘導(dǎo)和分化兩步接種后需先暗培養(yǎng)2 d外，其他培養(yǎng)條件均為每日光照16 h，光強(qiáng)2 000 lx，培養(yǎng)溫度為25 ℃/20 ℃（晝/夜）

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理時(shí)間、激素種類和配比對(duì)‘小白’花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表1可以看出，在72 h內(nèi)，低溫預(yù)處理均顯著提高了‘小白’花藥愈傷組織誘導(dǎo)率，其中T1條件下即4 ℃低溫預(yù)處理24 h效果最好；6-BA與KT、IAA和NAA的4種激素組合均提高了‘小白’花藥愈傷組織誘導(dǎo)率，其中M2即MS+ 6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L效果最好。綜合來看，在T1預(yù)處理下，采用M2誘導(dǎo)培養(yǎng)基，‘小白’草莓花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了75.33%，與其他處理差異性均達(dá)到了極顯著（見表1）。

表1 不同預(yù)處理時(shí)間、激素種類和配比對(duì)‘小白’花藥愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.2 不同激素種類和配比對(duì)‘小白’花藥愈傷組織分化、再生芽增殖的影響

從表2中可以看出，‘小白’草莓愈傷組織的分化率較低，在M6培養(yǎng)基即MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L中最高，達(dá)到18.67%，且叢生芽較大，玻璃化程度較輕；同時(shí)，其再生芽增殖系數(shù)也最高，達(dá)到了3.21，且再生芽長(zhǎng)勢(shì)健壯，無玻璃化現(xiàn)象。

表2 不同激素種類和配比對(duì)‘小白’花藥愈傷組織分化、再生芽增殖的影響

2.3 不同激素種類和配比對(duì)‘小白’再生芽生根的影響

由表3可以看出，‘小白’草莓再生芽在M9培養(yǎng)基即1/2MS條件下生根率最高，達(dá)到94.67%，在M10培養(yǎng)基中平均根長(zhǎng)最長(zhǎng)，達(dá)到3.24 cm，須根數(shù)量也最多，平均7個(gè)，但3種培養(yǎng)基間生根率、平均根長(zhǎng)、須根數(shù)量均無顯著性差異，結(jié)合組織培養(yǎng)成本考慮，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS。

表3 不同激素種類和配比對(duì)‘小白’再生芽生根的影響

3 討論與結(jié)論

草莓花藥經(jīng)過一段時(shí)間的低溫預(yù)處理可以顯著提高花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率，但不同品種間存在差異[5]。在本試驗(yàn)中，4 ℃低溫預(yù)處理24 h對(duì)‘小白’草莓花藥愈傷組織誘導(dǎo)效果最好，這與任建宏等[6]的研究結(jié)果一致，而與趙永欽等[7]結(jié)果不一致。

適當(dāng)濃度的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素配合使用，可以誘導(dǎo)草莓花藥產(chǎn)生高質(zhì)量的愈傷組織。在本試驗(yàn)中，6-BA、KT、IAA、NAA激素的4種組合均能促進(jìn)‘小白’花藥愈傷組織的形成，相同濃度下IAA效果好于NAA。而低溫預(yù)處理24 h、6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L的組合誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了75.33%。

不同激素種類和配比對(duì)草莓愈傷組織分化和叢生芽增殖的影響不同。本試驗(yàn)中，在M6培養(yǎng)基即MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L+GA 0.1 mg/L激素組合處理下，‘小白’草莓花藥愈傷組織分化率和叢生芽增殖系數(shù)均顯著高于其他處理，分別達(dá)到18.67%和3.21，是適合‘小白’草莓花藥愈傷組織分化與再生芽增殖的培養(yǎng)基配方。

草莓再生芽生根較為容易，本試驗(yàn)中，‘小白’草莓再生芽在3種培養(yǎng)基中生根率都達(dá)到了90%以上，相互間無顯著性差異，這與楊振英等[8]研究結(jié)果不同，可能是由于‘小白’草莓生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，對(duì)外源激素依賴程度較低的原因。因此，直接選用不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基即可滿足‘小白’草莓再生芽的生根需要。