譚 弘，蘇敬澤，韓 垚，魏執(zhí)真

（1.北京宣武中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050；2.北京中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100010）

膜片鉗是一種通過(guò)記錄離子通道的離子電流來(lái)反映細(xì)胞膜上離子通道分子活動(dòng)情況的技術(shù)，近年來(lái)膜片鉗技術(shù)發(fā)展迅速，為研究人員直接了解相關(guān)的門(mén)控動(dòng)力學(xué)特征以及離子通道的通透性及生理特征等信息提供了方法和依據(jù)[1]。目前膜片鉗技術(shù)已經(jīng)廣泛用于研究心肌細(xì)胞的離子通道活動(dòng)，從而了解心肌細(xì)胞活性和受體功能的改變情況，幫助研究人員進(jìn)一步明確相關(guān)藥理作用機(jī)制，對(duì)心臟疾病的診斷和治療提供理論依據(jù)支持[2]，尤其在心律失常藥物基礎(chǔ)研究方面，膜片鉗技術(shù)已成為最常用方法之一。

魏執(zhí)真教授是國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)，北京中醫(yī)醫(yī)院心內(nèi)科主任醫(yī)師。調(diào)脈飲乃魏老總結(jié)多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)所研制的用于治療快速性心律失常的有效經(jīng)驗(yàn)方，主要由牡丹皮、赤芍、太子參、麥冬、香櫞等中藥組成，功效以涼血清熱，益氣養(yǎng)心，行氣通脈為主。調(diào)脈飲拆方實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)加用涼血清熱藥赤芍、牡丹皮后與去赤芍、牡丹皮的行氣通脈、益氣養(yǎng)心組相比，對(duì)快速性心律失常的抑制作用更為顯著，且能夠降低心律失常的持續(xù)時(shí)間，表明2 種中藥對(duì)心律失常具有明確的治療作用，因此，本研究選擇2 種中藥的有效成分芍藥苷和丹皮酚進(jìn)行抗心律失常相關(guān)研究[3-4]。

芍藥苷是一種單萜類(lèi)糖苷化合物，是中藥芍藥的重要活性單體[5]，具有解痙、抗血小板聚集、增加冠脈血流量及保護(hù)急性缺血心肌等作用[6-8]。丹皮酚又稱(chēng)牡丹酚，是中藥牡丹皮和徐長(zhǎng)卿的主要活性成分，具有安眠鎮(zhèn)靜，抗動(dòng)脈粥樣硬化，抗血小板聚集，降低血壓等作用[9]。2 者皆為臨床常用中藥。本實(shí)驗(yàn)研究采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察芍藥苷及丹皮酚對(duì)hERG、Iks、Katp、Cav 3.2、HCN2、HCN4 等離子通道的影響，探討2 種藥物在離子通道水平上的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 芍藥苷（批號(hào)：L07M9Q60533）與丹皮酚（批號(hào)：L15D9D77791）購(gòu)自宣武醫(yī)院，白色粉末狀，純度均≥98%，2～8℃保存。芍藥苷用甲醇配制成2.04 mM 儲(chǔ)液，用甲醇將供試品儲(chǔ)液稀釋成為1 mM 的稀釋液，用10 mL 的細(xì)胞外液將稀釋液稀釋?zhuān)涑? uM,10 uM 液體。丹皮酚用乙醇配制成5.898 mM 儲(chǔ)液，用乙醇將供試品儲(chǔ)液稀釋成為1 mMd 稀釋液，用10 mL 的細(xì)胞外液將稀釋液稀釋?zhuān)涑? μM，10 μΜ 液體。供試品和陽(yáng)性對(duì)照品儲(chǔ)液保存在-20℃，供試品工作液及陽(yáng)性對(duì)照品工作液需在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天配制，并在室溫環(huán)境保存。

1.2 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 本研究采用心臟離子通道穩(wěn)定表達(dá)的HEK293 或CHO 細(xì)胞系，分別表達(dá)基因如下：1）hERG（KCNH2）基因信息：NM_ 000238；2）IKs（KCNQ1/ KCNE1）基因信息：NM_000218 和NM_ 000219；3）KATP（KCNJ11/SUR2A）基因信息：NM_000525 和NM_ 005691；4）Cav 3.2（CACNA1H）基因信息：NM_ 021098；5）HCN2 基因信息：NM_ 001194；6）HCN4 基因信息：NM_005477。上述所有細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DMEM 或F12 培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)，以備膜片鉗實(shí)驗(yàn)用。為了維持基因表達(dá)，細(xì)胞外液根據(jù)基因抗性加入0.8 mg/mL G418 或200 μg/mL Hygromycin B。為維持細(xì)胞的離子通道表達(dá)，細(xì)胞的密度均不超過(guò)80%。

1.3 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞培養(yǎng) 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞購(gòu)于南京百壽生物科技有限公司（NovoCellTM）。在溫度為4℃冰面上添加心肌細(xì)胞鋪板液至完全覆蓋培養(yǎng)皿/瓶中底部，37℃包被過(guò)夜。將用液氮保存的NovoCellTM 心肌細(xì)胞（20180915）以37℃水浴。消毒凍存管外表面后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，以 DPBS 稀釋細(xì)胞懸液后，300 g 離心5 min。祛上清后加入心肌細(xì)胞復(fù)蘇液（Plating Medium 400201），將混勻的細(xì)胞懸液接種到包被過(guò)的培養(yǎng)皿/瓶中，八字晃動(dòng)使之均勻分布。5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h 后，更換成心肌細(xì)胞培養(yǎng)基(Maintenace Medium 400305)，每48 h 換液1 次。

1.4 膜片鉗記錄 毛細(xì)玻璃管經(jīng)微電極拉制儀拉制成記錄電極。在倒置顯微鏡下將玻璃電極接觸到細(xì)胞上，之后快速給予一定的負(fù)壓使細(xì)胞膜表面吸附至玻璃電極尖端，形成高阻封接。形成高阻封接后開(kāi)始快速進(jìn)行電容補(bǔ)償，再繼續(xù)給予負(fù)壓直至吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄模式。然后進(jìn)行慢速電容的補(bǔ)償并記錄膜電容及串聯(lián)電阻。未給予漏電補(bǔ)償。

在倒置顯微鏡下進(jìn)行記錄，當(dāng)記錄電流保持3～5 min 穩(wěn)定后開(kāi)始給藥處理，從低濃度到高濃度依次給藥，每個(gè)藥物濃度作用時(shí)間5 min 左右，決定給予下一個(gè)濃度的依據(jù)是前一個(gè)濃度能穩(wěn)定1 min 左右的電流大小。利用重力給藥系統(tǒng)將含不同濃度的測(cè)試化合物以及不含化合物的細(xì)胞外液按照濃度高低從低到高依次流經(jīng)顯微鏡記錄浴槽并作用于細(xì)胞，同時(shí)使用真空泵進(jìn)行液體交換。每一個(gè)細(xì)胞在不含化合物的外液中檢測(cè)到的電流作為自己的對(duì)照組。獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)2個(gè)細(xì)胞。所有試驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。記錄各種心臟離子通道電流的條件如下：

1.4.1 快速延遲整流鉀電流（hERG）細(xì)胞外液（mmol/L）NaCl 140,KCl 3.5,MgCl21,CaCl22,Glucose 10,HEPES 10,NaH2PO41.25,NaOH 調(diào)節(jié)pH=7.4；細(xì)胞內(nèi)液（mmol/L）KCl 20,K-Aspartic 115,MgCl21,EGTA 5,HEPES 10,Na2-ATP 2，KOH 調(diào)節(jié)pH=7.2。細(xì)胞holding電壓鉗制于-80 mV，之后鉗制電壓去極化至+30 維持2.5 s，之后恢復(fù)至-50 mV 維持4 s，每隔10 s 重復(fù)采集數(shù)據(jù)，觀察對(duì)藥物hERG 尾電流的作用。

1.4.2 緩慢延遲整流鉀電流（Iks）細(xì)胞外液（mmol/L）NaCl 140,KCl 3.5,MgCl21,CaCl22,Glucose 10,HEPES 10,NaH2PO41.25,NaOH 調(diào)節(jié)pH=7.4；細(xì)胞內(nèi)液（mmol/L）K-Aspartic 120,MgCl25,EGTA 5,HEPES 10,Na2-ATP 4,Na2-GTP 0.3,Phosphocreatine disodium salt 14,20 u/mL Creatine phosphor kinse，KOH 調(diào)節(jié)pH=7.2。細(xì)胞holding 電壓鉗制于-80 mV。鉗制電壓由-80 mV 去極化至+60 mV 維持5 s，然后階躍至-40 mV 維持4 S，以此刺激出IKs 通道的尾電流，間隔20 s 重復(fù)記錄，記錄給藥前后IKs 電流峰值的影響。

綜上所述，體外沖擊波聯(lián)合扶他林乳膠劑可更好地發(fā)揮體外沖擊波的物理生物學(xué)效應(yīng)和扶他林消炎鎮(zhèn)痛的效果，并產(chǎn)生疊加效應(yīng)，從而顯著提高OA患者的膝關(guān)節(jié)功能，減輕膝關(guān)節(jié)疼痛癥狀。但在臨床應(yīng)用過(guò)程中沖擊波的沖擊強(qiáng)度、頻率以及治療周期等參數(shù)還有待規(guī)范，并且本研究觀察周期短，其長(zhǎng)期療效及治療機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

1.4.3 ATP 敏感鉀通道（KATP）細(xì)胞外液（mmol/L）NaCl 140,KCl 3.5,MgCl21,CaCl22,Glucose 10,HEPES 10,NaH2PO41.25,NaOH 調(diào) 節(jié)pH=7.4；細(xì) 胞內(nèi) 液（mmol/L）KCl 20,K-aspartic 115,HEPES 10,MgCl21,EGTA 5,KOH 調(diào)節(jié)pH=7.2。細(xì)胞holding 電壓鉗制于-70 mV，之后階躍至-110 mV 維持100 ms，執(zhí)行Ramp 刺激至10 mV，維持1 000 ms，每隔10 s 重復(fù)采集數(shù)據(jù)，記錄給藥前后Katp 鉀通道電流的影響。細(xì)胞外液中加入100 μM Pinacidil 激發(fā)Katp 電流。

1.4.4 T 型鈣電流（Cav3.2）細(xì)胞外液（mmol/L）TEA-Cl 140，MgCl22，CaCl210,HEPES 10,Glucose 5,TEA-OH 調(diào)節(jié)pH=7.4；CsCl 120，MgCl21，HEPES 10,Mg-ATP 4，EGTA 10，Na2-GTP 0.3,CsOH 調(diào)節(jié)pH=7.2。細(xì)胞holding 電壓鉗制于-60 mV。鉗制電壓由-60 mV去極化至+10 mV 維持0.3 s，每隔20 s 重復(fù)采集數(shù)據(jù)，記錄給藥前后T 型鈣通道電流峰值，并計(jì)算作用效應(yīng)。

1.4.5 超極化激活的環(huán)化核苷酸門(mén)控通道電流（HCN2，HCN4）細(xì)胞外液（mmol/L）NaCl 75,KCl 60,HEPES 10,Glucose 10,NaH2PO41.25,MgCl21,CaCl2 2,NaOH 調(diào)節(jié)pH=7.4；細(xì)胞內(nèi)液（mmol/L）NaCl 1,140 K-Gluconate,CaCl20.1,MgCl21,HEPES 10,EGTA 1,Mg-ATP 2,NaOH調(diào)節(jié)pH=7.2。細(xì)胞holding 電壓鉗制于-30 mV，鉗制電壓由-30 mV 階躍至-120 mV 保持1 000 ms，最后恢復(fù)至holding 電壓-30 mV，記錄給藥前后通道電流峰值的影響。

1.4.6 干細(xì)胞誘導(dǎo)分化心肌細(xì)胞動(dòng)作電位 細(xì)胞外液（mmol/L）NaCl 140,KCl 3.5,MgCl21,CaCl22,Glucose 10,HEPES 10,NaH2PO41.25,NaOH 調(diào)節(jié)pH=7.4；細(xì)胞內(nèi)液（mmol/L）KCl 20,K-Aspartic 115,MgCl21,EGTA 5,HEPES 10,Na2-ATP 2，KOH 調(diào)節(jié)pH=7.2。當(dāng)形成全細(xì)胞封接后，轉(zhuǎn)為電流鉗模式，細(xì)胞膜電流鉗制于0 pA，連續(xù)記錄心肌細(xì)胞自發(fā)動(dòng)作電位。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)由EPC-10 放大器（HEKA）進(jìn)行采集并儲(chǔ)存于PatchMaster（HEKA）軟件中。首先將每一個(gè)藥物濃度作用后的電流和空白對(duì)照電流標(biāo)準(zhǔn)化，然后計(jì)算每一個(gè)藥物濃度對(duì)應(yīng)的抑制率。對(duì)每一個(gè)濃度計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，典型電流趨勢(shì)圖以及電流圖利用IGOR 軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對(duì)各離子通道的抑制比例結(jié)果比較 見(jiàn)表1。

表1 芍藥苷對(duì)各離子通道的抑制比例結(jié)果比較 %

2.2 丹皮酚對(duì)各離子通道的抑制作用結(jié)果比較 見(jiàn)表2。

表2 丹皮酚對(duì)各離子通道的抑制作用結(jié)果比較 %

2.3 2 種濃度藥物對(duì)離子通道的抑制作用結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3 2 種濃度藥物對(duì)離子通道的抑制作用結(jié)果比較 %

結(jié)果顯示2 組不同濃度的藥物對(duì)離子通道的抑制作用具有顯著性差異。10 uM 濃度的藥物對(duì)離子通道的抑制作用明顯優(yōu)于1 uM。芍藥苷及丹皮酚對(duì)離子通道的阻斷作用皆具有濃度依賴(lài)的特點(diǎn)。針對(duì)不同的離子通道，芍藥苷對(duì)Cav 3.2 離子通道的抑制作用較明顯，如圖1 所示，丹皮酚對(duì)IKs 通道的抑制作用較顯著，如圖2 所示。

圖1 芍藥苷對(duì)Cav 3.2 通道作用

圖2 丹皮酚對(duì)IKs 通道作用

3 討論

芍藥苷是中藥芍藥的主要有效成分之一。既往研究證明芍藥苷對(duì)心肌L 型鈣通道、鉀離子通道IK1有確切的抑制作用，并且濃度越高阻滯作用越明顯[10-11]。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示芍藥苷對(duì)多個(gè)離子通道的電流均有一定的抑制作用，而且均呈濃度依賴(lài)性，尤其對(duì)Cav 3.2 離子通道峰值電流的抑制作用較顯著。Cav 3.2 是T 型鈣通道的一種，T 型鈣通道多分布于心臟，神經(jīng)和內(nèi)分泌等系統(tǒng)。心肌細(xì)胞膜上主要存在L型及T 型2 種鈣通道。T 型鈣通道在竇房結(jié)、房室結(jié)及浦肯野纖維等心臟起搏和傳導(dǎo)系統(tǒng)中分布較廣泛，主要起到維持心臟自律性的作用，因此當(dāng)心肌T 型鈣通道的分布出現(xiàn)變化時(shí)，心肌細(xì)胞的自律性不能維持，往往導(dǎo)致心律失常的發(fā)生[12]。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示芍藥苷對(duì)Cav 3.2 離子通道的阻斷作用明顯，因此可以對(duì)竇房結(jié)、房室結(jié)等傳導(dǎo)系統(tǒng)起到一定的抑制作用，從而起到減慢心率，治療快速性心律失常的作用。除了在維持心肌細(xì)胞自律性中發(fā)揮重要作用，T 型鈣通道還與細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)關(guān)系密切[13-14]，心肌肥大時(shí) T 型鈣通道表達(dá)明顯增多。心肌細(xì)胞肥大病理改變常見(jiàn)于心衰患者，而在心衰患者中心律失常發(fā)病率極高，是導(dǎo)致患者猝死的主要原因之一。因此芍藥苷可能具有抑制心肌重構(gòu)效應(yīng)，較適用于快速性心律失常合并心衰的患者。

丹皮酚是牡丹根的有效成分之一。既往研究證實(shí)，丹皮酚對(duì)心肌鈣離子通道電流具有抑制作用[15]，可以用于治療心律失常[16]。本次研究結(jié)果顯示丹皮酚對(duì)IKs 通道的抑制作用較為明顯，并且也表現(xiàn)出濃度依賴(lài)性的特點(diǎn)。IKs 通道是鉀離子通道的一種。鉀離子通道主要在心肌動(dòng)作電位的復(fù)極過(guò)程發(fā)揮作用，主要由IKr和IKs 2 種離子通道組成。IKs 通道為慢激活的延遲整流鉀電流，是目前臨床常用III 類(lèi)抗心律失常藥起效的重要作用靶點(diǎn)，主要作用于動(dòng)作電位后期平臺(tái)期。IKs阻斷劑可以有效延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，起到抗心律失常的作用。有研究認(rèn)為相對(duì)于IKr 阻斷劑，IKs 阻斷劑致心律失常副作用更低，安全性更高[17]。課題組前期結(jié)果已經(jīng)證實(shí)調(diào)脈飲能夠降低心肌LTCC β2的表達(dá)及L型鈣通道活性，減少鈣超載[3]，還可以延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程和動(dòng)作電位有效不應(yīng)期[18]，結(jié)合本次研究結(jié)果課題組認(rèn)為芍藥苷和丹皮酚均為調(diào)脈飲的重要組成部分，其對(duì)Cav 3.2 通道和IKs 通道的抑制作用極有可能是調(diào)脈飲發(fā)揮抗心律失常作用的機(jī)制之一。本研究結(jié)果亦顯示出2種中藥對(duì)多個(gè)離子通道均有一定的抑制作用，因此調(diào)脈飲方抗心律失常作用應(yīng)是通過(guò)多靶點(diǎn)聯(lián)合作用，阻斷多個(gè)離子通道電流活性實(shí)現(xiàn)的。

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，射頻消融、起搏器等治療心律失常的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但由于有創(chuàng)的操作方式、價(jià)格昂貴、臨床適應(yīng)癥等原因，藥物仍是心律失常的一線治療手段。傳統(tǒng)西藥雖然具有起效快、療效明確的優(yōu)勢(shì)，但在發(fā)揮臨床療效作用的同時(shí)，也可產(chǎn)生多種不良反應(yīng)，尤其藥物致心律失常發(fā)生率較高，導(dǎo)致患者依從性低，增加臨床治療難度。并且西藥以單離子通道阻斷劑多見(jiàn)，作用靶點(diǎn)較單一，抗心律失常譜相對(duì)較窄，臨床使用受限較多。相對(duì)于單離子通道阻斷劑而言，多離子通道阻斷劑具有更好的調(diào)節(jié)和控制作用，能夠更好的促進(jìn)離子通道功能恢復(fù)，致心律失常不良反應(yīng)發(fā)生率較低[19]，甚至還可以起到抑制心肌重構(gòu)，改善患者預(yù)后，提高生活質(zhì)量的積極作用[20]。因此在中草藥中尋找更安全、更有效的防治藥物，是開(kāi)發(fā)抗心律失常藥物的重要?jiǎng)?chuàng)新途徑。

近年來(lái)由于膜片鉗技術(shù)在中藥研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，越來(lái)越多關(guān)于中藥對(duì)離子通道的調(diào)控作用被揭示出來(lái)。大量研究結(jié)果表明在抗心律失常方面，中藥具有良好的治療效果，并且適應(yīng)癥更廣，應(yīng)用前景廣泛，副作用小，價(jià)格相對(duì)低廉，安全性亦更強(qiáng)。但由于中藥作用靶點(diǎn)較多，作用機(jī)制復(fù)雜，仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證和數(shù)據(jù)挖掘。此次試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥對(duì)離子通道的作用與藥物濃度關(guān)系密切，即藥物濃度越高對(duì)離子通道的阻斷作用越明顯，這也與之前許多相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果相吻合。因此在以后的試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)立多個(gè)給藥濃度，從而確定最有效的治療濃度。目前中藥臨床應(yīng)用多以復(fù)方為主，中藥復(fù)方組成復(fù)雜，成分眾多，存在多個(gè)中藥單體可以同時(shí)發(fā)揮抗心律失常效應(yīng)甚至增加協(xié)同作用的情況，而目前針對(duì)離子通道的研究主要以中藥單體或中藥拆方多見(jiàn)，因此要在今后的研究中增加不同的藥對(duì)或藥物組合，尤其是關(guān)于藥物交叉作用的離子通道研究，以便更加精確找到中藥抗心律失常的作用靶點(diǎn)，將對(duì)中醫(yī)中藥發(fā)揮治療心律失常等心臟疾病具有極其重大的意義。